1、一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌 BL21/pETSCR6768(Escherichia coli BL21/pETSCR6768)，已保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M208079。

2、利用定点突变后构建的重组菌CCTCC NO：M208079不对称转化制备(R)- 苯基乙二醇的方法，其特征是以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应： 在1mL 0.1mol/L pH 4.5～6.5的醋酸缓冲液，或1mL 0.1mol/L pH 6.0～7.0的磷酸 缓冲液，或1mL 0.1mol/L pH 8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中，2-羟基苯乙酮底物 浓度为5g/L，反应温度30℃；

采用重组菌全细胞生物转化：重组菌细胞浓度为0.1～0.2g/mL，反应时间为 48h，反应前不需要加入辅酶，产物为(R)-苯基乙二醇；

或采用重组菌的蛋白细胞破碎后经纯化后的重组蛋白生物转化：重组蛋白 浓度为1～2μg/mL，反应时间为8h，反应前加5mmol/L辅酶NADH，产物为 (R)-苯基乙二醇。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌的培养

LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；固体 培养基添加琼脂粉1.5％；

培养条件：挑取重组菌株CCTCC NO：M208079的单菌落接种于3mL含 100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜， 取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于 37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6后，培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫 代半乳糖苷1mmol/L，诱导培养温度30℃，诱导培养过夜，10,000rpm离心10 min，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征是重组蛋白的纯化

菌体收集：将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎：工 作时间4s，间歇时间6s，共20min；破碎液16,000rpm离心40min；弃沉淀， 取上清进行后续的蛋白纯化工作；

蛋白纯化：先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍，用MCAC-50缓冲液 洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitrap 柱蛋白脱盐，利用Pharmacia公司的蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐 的缓冲液；接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱，1×1cm，进行 蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的Superdex 200，HiLoad 26/60，进行蛋白纯 化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到90％以上。

5、权利要求1所述重组突变菌株CCTCC NO：M208079的构建方法，其特 征是将突变基因片断scr6768插入载体pET21c构建重组质粒pETSCR6768，重 组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄 青霉素的LB平板筛选，获得目的重组菌株E.coli BL21/pETSCR6768。

6、根据权利要求5所述的构建方法，其特征是重组质粒pETSCR6768的构 建：利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因片断scr6768和载体pET21c 分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有目的基因 片断的重组质粒pETSCR6768。

7、根据权利要求5所述的构建方法，其特征是突变基因片断scr6768的获 得：以含有(S)-专一性羰基还原酶的重组质粒pETCPADH作为PCR扩增反应模 板，利用含有BamHI限制性酶切位点的引物1，含有XhoI限制性酶切位点的 引物2，中间两段引物3和引物4，引物1：5’-ATC GGATCC GATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’，

引物2：5’-TGACTCTCGAGTGGACACGTGTATCCACCGTC-3’，

引物3：5’-CCATTTGGTACAACGATGATCCAGC-3’，

引物4：5’-CTCATCAGCTGGATCATCGTTGTAC-3’，

通过SOE-PCR反应扩增，获得scr6768基因，其全长为837bp；

上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以重组质粒pETCPADH为模板， 分别以引物1和4，引物2和3进行PCR反应，PCR反应体系：ddH2O 37μL， 10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物1和4，或 引物2和3各引物1μL，重组质粒pETCPADH 1μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.5μL；

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min， 进行30个循环；72℃延伸10min；获得上游cDNA片段及下游cDNA片段；

将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNA Polymerase延伸10min补成双链，作下一次的PCR模板，PCR反应条件：94℃ 3min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，即获得 scr6768基因，该基因编码将(S)-专一性羰基还原酶蛋白序列中的第67位的Ser 和第68位His均突变为Asp。