1.一种TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测引物组,其特征在于包含引物TGEV‑F、TGEV‑R、PEDV‑F、PEDV‑R、SADS‑F、SADS‑R、PDCoV‑F和PDCoV‑R,其核苷酸序列如下所示:引物TGEV‑F:5′‑GTATGAAGCGTAGTGGTTATGGTC‑3′;
引物TGEV‑R:5′‑AATAGGTTATGACAGGTTCACAATC‑3′;
引物PEDV‑F:5′‑TTTCACATGGAATATCATACTGACG‑3′;
引物PEDV‑R:5′‑ATGAAGCACTTTCTCACTATCTGT‑3′;
引物SADS‑F:5′‑TCCTGAGGAAGAGGTTGAGATGGT‑3′;
引物SADS‑R:5′‑CGTGCTTACCATTGTGTATGAGAC‑3′;
引物PDCoV‑F:5′‑AGACACTGAGAAGACGGGTATGG‑3′;
引物PDCoV–R:5′‑CTTCTTGTCCTTAGTTGGTTTGGT‑3′。
2.权利要求1所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测引物组在检测TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV领域中的应用,其特征在于:所述的应用不包含疾病的诊断目的。
3.一种TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒,其特征在于包含权利要求1所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测引物组。
4.根据权利要求3所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒,其特征在于还包含RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、Random primer、RNase inhibitor、M‑MLV、5×M‑MLV Buffer。
5.根据权利要求4所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒,其特征在于包含RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、Random primer、RNase inhibitor、M‑MLV、5×M‑MLV Buffer;浓度为10μmol/L的TGEV‑F、浓度为10μmol/L的TGEV‑R、浓度为10μmol/L的PEDV‑F、浓度为10μmol/L的PEDV‑R、浓度为10μmol/L的SADS‑F、浓度为10μmol/L的SADS‑R、浓度为10μmol/L的PDCoV‑F、浓度为10μmol/L的PDCoV‑R。
6.权利要求3~5任一项所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV中的应用,其特征在于:所述的应用不包含疾病的诊断目的。
7.根据权利要求6所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV中的应用,其特征在于包含如下步骤:(1)以待测样品RNA为模板,以Random primer为扩增引物,配制反转录反应体系,进行样品RNA的反转录反应,得到cDNA;
(2)以步骤(1)制得的反转录反应产物cDNA为模板,以混合引物TGEV‑F、TGEV‑R、PEDV‑F、PEDV‑R、SADS‑F、SADS‑R、PDCoV‑F、PDCoV‑R为扩增引物,配制多重PCR反应体系,进行多重PCR反应;
(3)将步骤(2)制得的多重PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;结果判定方法为:在
801bp处出现目的条带的判定为TGEV阳性扩增,616bp处出现目的条带的判定为PEDV阳性扩增,368bp处出现目的条带的判定为SADS‑CoV阳性扩增,250bp处出现目的条带的判定为PDCoV阳性扩增,在801bp处未出现目的条带的判定为TGEV阴性扩增,616bp处未出现目的条带的判定为PEDV阴性扩增,368bp处未出现目的条带的判定为SADS‑CoV阴性扩增,250bp处未出现目的条带的判定为PDCoV阴性扩增。
8.根据权利要求7所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV中的应用,其特征在于:步骤(1)中所述的反转录反应的反应体系为:
9.根据权利要求7所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV中的应用,其特征在于:步骤(2)中所述的多重PCR反应的反应体系为:
10.根据权利要求7所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV中的应用,其特征在于:步骤(2)中所述的多重PCR反应的参数如下所示:
95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸
10min。