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专利号: 2018106089252
申请人: 四川师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于,依次包括以下步骤:(1)模板RNA的提取和逆转录:在实体显微镜下,用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位,并停留2-3秒,然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应,以便进行逆转录,得到cDNA;

(2)PCR反应:将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应,得到反应产物;

(3)结果判断:将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析,得到检测结果。

2.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述待检植物组织样品为已鉴定为感染葡萄卷叶病毒3即GLRav-3、苹果茎沟病毒即ASGV、马铃薯卷叶病毒即PLRV或黄瓜花叶病毒即CMV其中一种的样品。

3.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述的某一部位为茎、叶柄或根。

4.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述无菌注射器针大小为26G、25G或23G。

5.根据权利要求4所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述无菌注射器针最适大小为26G。

6.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述逆转录混合物包含5μL 5X TRUE RT MasterMix和20μL RNase-free ddH20。

7.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述在逆转录混合物中进行反应的调节为室温中反应15分钟。

8.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(2)所述PCR反应方法为:在25μL PCR管配制反应体系,0.5μM引物混合液2μL,

2x Taq DNA polymerase Mix 12.5μL,模板cDNA 2μL,RNase-free ddH20补齐到25μL。

9.根据权利要求8所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(2)中:葡萄卷叶病毒3检测的PCR反应程序:94℃保持30s,52℃保持30s,72℃保持60s,最后的扩增步骤是72℃保持7min,重复这样的循环35次,然后在4℃冷藏;

苹果茎沟病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,54℃保持45s,72℃保持60s,最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环35次,然后在4℃冷藏;

马铃薯卷叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持30s,50℃保持30s,72℃保持30s,最后的扩增步骤是72℃保持10min,重复这样的循环35次,然后在4℃冷藏;

黄瓜花叶病毒检测的PCR反应程序:94℃保持15s,54℃保持30s,72℃保持30s,最后的扩增步骤是72℃保持5min,重复这样的循环30次,然后在4℃冷藏。

10.根据权利要求1所述的采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(3)中,所述电泳分析为2%琼脂糖凝胶电泳分析。