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专利号: 2018106089252
申请人: 四川师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种采用植物微组织直接 RT‑PCR 检测多种植物病毒的方法,其特征在于,依次包括以下步骤:(1)模板 RNA 的提取和逆转录:在实体显微镜下,用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位,并停留 2‑3 秒,然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应,以便进行逆转录,得到 cDNA;

(2)PCR 反应:将步骤(1)得到的 cDNA 进行 PCR 反应,得到反应产物;

(3)结果判断:将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析,得到检测结果;

步骤(1)所述无菌注射器针最适大小为 26G;

步骤(1)所述待检植物组织样品为已鉴定为感染葡萄卷叶病毒 3 即 GLRav‑3、苹果茎沟病毒即 ASGV、马铃薯卷叶病毒即 PLRV 或黄瓜花叶病毒即 CMV 其中一种的样品;

步骤(1)所述的某一部位为茎、叶柄或根。

2.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT‑PCR 检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述逆转录混合物包含 5μL 5× TRUE RT MasterMix和 20μL RNase‑free ddH2O 。

3.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT‑PCR 检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(1)所述在逆转录混合物中进行反应的条件 为室温中反应 15 分钟。

4.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT‑PCR 检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(2)所述 PCR 反应方法为:在 25μL PCR 管配制反应体系,0.5μM 引物混合液 2μL,2× Taq DNA polymerase Mix 12.5μL,模板cDNA 2μL,RNase‑free ddH2O 补齐到 25μL。

5.根据权利要求 4 所述的采用植物微组织直接 RT‑PCR 检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(2)中:葡萄卷叶病毒 3 检测的 PCR 反应程序: 94℃保持 30s, 52℃保持 30s, 72℃保持

60s,最后的扩增步骤是 72℃保持 7min, 重复这样的循环 35 次,然后在 4℃冷藏;

苹果茎沟病毒检测的 PCR 反应程序: 94℃保持 30s, 54℃保持 45s, 72℃保持60s,最后的扩增步骤是 72℃保持 5min, 重复这样的循环 35 次,然后在 4℃冷藏;

马铃薯卷叶病毒检测的 PCR 反应程序: 94℃保持 30s, 50℃保持 30s,72℃保持

30s,最后的扩增步骤是 72℃保持 10min, 重复这样的循环 35 次,然后在 4℃冷藏;

黄瓜花叶病毒检测的 PCR 反应程序: 94℃保持 15s, 54℃保持 30s, 72℃保持

30s,最后的扩增步骤是 72℃保持 5min, 重复这样的循环 30 次,然后在 4℃冷藏。

6.根据权利要求 1 所述的采用植物微组织直接 RT‑PCR 检测多种植物病毒的方法,其特征在于:步骤(3)中,所述电泳分析为 2%琼脂糖凝胶电泳分析。