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专利号: 2018106632446
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-04-17
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法,其特征在于:包括,以反式茴香脑加氧酶基因为模板,进行易错PCR,获得反式茴香脑加氧酶突变体文库;

将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶突变体的溶液中进行催化反应,将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应,并加入碱溶液及有机溶剂反应,测定吸光度。

2.如权利要求1所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法,其特征在于:

所述易错PCR,包括设计易错PCR引物,所述易错PCR引物为:

taoF:TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGCtaoD:GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。

3.如权利要求1或2所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法,其特征在于:

所述获得反式茴香脑加氧酶突变体文库,包括以重组质粒PGEX-6P-1-tao为模板,rTaq-1 2+聚合酶进行易错PCR获得随机突变,PCR体系中添加浓度为7~10mmol·L 的Mg 以及30~

250μmol·L-1的Mn2+,PCR产物连接至线性质粒PGEX-6P-1,再将连接产物导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,获得反式茴香脑加氧酶突变体文库。

4.如权利要求3所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法,其特征在于:所述进行显色反应,包括,将导入感受态细胞的反式茴香脑加氧酶突变体文库涂布平板,挑取单菌落接种于含有100mg·L-1的氨苄青霉素的LB培养基中,诱导培养,离心获得菌体,加入100~200μL的缓冲液混匀菌体,添加终浓度为0.1~1.0g·L-1的反式茴香脑加氧酶反应底物,

28~37℃催化反应20~120min,取反应上清液与2,4-二硝基苯肼显色剂于10~40℃反应5~40min,再加入0.5~3mol·L-1的NaOH以及0~80%的乙醇溶液,10~40℃溶解沉淀,用酶标仪测定吸光度OD470。

5.权利要求1、2或4任一所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法,其特征在于:所述反式茴香脑加氧酶的反应底物,包括4-丙烯基-2-甲氧基苯酚、反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯、1,2-二甲氧基-4-丙烯基苯。

6.如权利要求3所述的反式茴香脑加氧酶突变体的高通量筛选方法,其特征在于:所述重组质粒PGEX-6P-1-tao,是将来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JYR-1的反式茴香脑加氧酶基因连接到质粒PGEX-6P-1。

7.一种权利要求1~6任一所述的高通量筛选方法得到的反式茴香脑加氧酶突变体,其特征在于:所述反式茴香脑加氧酶突变体为E.Coli BL21(DE3)-3G2,其氨基酸特征序列如SEQ ID NO 1所示。

8.如权利要求7所述的反式茴香脑加氧酶突变体,其特征在于:所述反式茴香脑加氧酶突变体为E.Coli BL21(DE3)-3G2,其有三个碱基发生突变,分别为211G变为T、330A变为G以及746G变T;相比于反式茴香脑加氧酶野生型的氨基酸序列,其有两个氨基酸发生变化,分别为71Val变为Leu,249Gly变为Cys。

9.一种反式茴香脑加氧酶突变菌株,其特征在于:所述反式茴香脑加氧酶突变菌株包含权利要求7或8所述的反式茴香脑加氧酶突变体,所述反式茴香脑加氧酶突变菌株为LSQ-

3,所述LSQ-3全细胞催化4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯和反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯合成的洋茉莉醛和对茴香醛的催化效率显著提高。