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专利号: 2016110623987
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2025-04-21
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法,其特征在于:其将捕获探针固定到金电极上,然后将不同浓度的目标DNA、辅助探针和固定在电极表面的捕获探针混合杂交,电化学法检测响应电流值;具体步骤如下:(1)金电极的预处理:将金电极在氧化铝粉末上打磨;后依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中40KHz超声清洗2-3 min;清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化,扫描范围从-0.4V至+1.5V,扫描速度100mV/s,直到获得稳定的CV图为止;将处理后的金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干;

(2)捕获探针的固定:将合成好的捕获探针用10mM PBS缓冲液溶解,-20℃冰箱中保藏;

将捕获探针用PBS缓冲液稀释;将100μL、0.3μM的捕获探针溶液倒扣到步骤(1)处理所得金电极上,使得捕获探针在金电极表面上形成自组装单分子层;用2mM巯基己醇封闭金电极

4h,得到修饰有捕获探针的金电极;用超纯水淋洗电极,氮气吹干待用;

(3)捕获探针、目标DNA以及辅助探针之间的杂交:将步骤(2)所得修饰有捕获探针的金电极浸没到100 μL的反应体系中,室温反应2h;所述反应体系为:0.8μM辅助探针、一定浓度的目标DNA、双蒸水及20mM PBS缓冲液;

(4)G-四链体-血红素复合物的形成:将200μL的G-四链体形成液倒扣在电极上,室温下放置30min;向G-四链体形成液中加入2μL 20mM血红素混匀;将反应液继续倒扣到电极上,室温下放置1h;用超纯水冲洗电极,用于电化学检测;

(5)电化学检测:

a、电化学反应:采用三电极系统,步骤(4)所得金电极作为工作电极,Ag/AgCl作为参比电极,铂丝作为对电极;工作溶液为含pH 7.4、20 mM KCl的20 mM HEPES缓冲液,检测前先通入氮气30 min;

b、标准曲线的绘制:检测方法为差分脉冲伏安法DPV,扫描范围-0.6~-0.15 V,振幅50 mV;取一系列不同浓度的目标DNA,以步骤(1)-(4)同样操作后对其进行检测,绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线;

c、检测:对于未知浓度目标DNA样品,按上述步骤(1)-(4)同样操作后对其进行检测,测得峰电流后从标准曲线可读出其浓度值。

2.根据权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法,其特征在于:所述辅助探针两端均含有能与目标DNA互补配对的核酸序列,而中间含有能形成G-四链体的碱基序列,具体为

5’-目标序列后11个碱基的互补序列+ TTTGGGTAGG GCGGGTTGGG CT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’;

所述捕获探针具体为5’-HS-(CH2)6-TT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’。

3.根据权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法,其特征在于:所述PBS缓冲液中含有1mM Mg2+、1M NaCl,其pH为

7.4。

4.根据权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法,其特征在于:所述G-四链体形成液为每10 mM HEPES缓冲液中含有50mM KCl,其pH为8.0。

5.权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法的应用,其特征在于:对HIV DNA样品的浓度进行了检测,以HIV基因片段作为目标DNA,其序列为:

5’- GGCAGCAATT TCACCAGTAC TA -3’ ;

相应的,设计其捕获探针序列为:5’- HS-(CH2)6-TTTAGTACTG GTG -3’;

设计辅助探针序列为:

5’-AAATTGCTGC CTTTGGGTAG GGCGGGTTGG GCTTAGTACT GGTG -3’;其中斜体部分表示可以形成G-四链体的碱基。