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专利号: 2019108370921
申请人: 华侨大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,包括如下步骤:

1)对待测DNA采用微球菌核酸酶—MNase进行片段化并产生3’‑磷酸末端和3’‑OH末端,该3’‑磷酸末端不能被加尾;

2)对片段化的待测DNA的3’‑OH末端进行第一次加尾;

3)对第一次加尾后的样品通过以下步骤捕获和识别全基因组中DNA单链断裂—SSBs的位置:首先,使用5’‑DNA‑RNA‑3’ 嵌合引物对加尾后的片段进行线性扩增;

其次,对扩增产物的3’末端进行第二次加尾;所述的第一次加尾和第二次加尾所用的碱基不互补;

最后, 目标产物通过包含接头序列的寡核苷酸进行PCR扩增建库并进行二代测序;

4)通过测序结果确定SSBs位置。

2.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤1)所述的片段化后的产物长度范围为150‑500碱基对。

3.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:所述的5’‑DNA‑RNA‑3’嵌合引物,能在所使用的反应条件下退火结合至第一次加尾上。

4.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤3)第二次加尾,使用dCTP加尾时长度范围为10‑100碱基。

5.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:所述的接头序列为包括Illumina在内的二代测序系统所用的接头序列。

6.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤4)通过序列分析确定SSBs位置,包括:(1)筛选出符合以下要求的双端原始序列:序列1以第二次加尾碱基互补和数量对应的碱基开头,序列2以第一次加尾碱基互补和数量对应的碱基开头;

(2)筛选出的序列比对待测生物体的基因数据库;只保留序列1和序列2都能够特异性比对到合适的结构和间隔的成对序列;

(3)在比对出的序列中,去除其序列2中5’端前15‑25bp的T碱基含量>40%的成对序列,SSB位点被定义为序列2中引物的对应数量碱基后的第一个碱基。

7.根据权利要求6所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:步骤(3)中,去除其序列2中5’端前20bp的T碱基含量>40%的成对序列。

8.根据权利要求6所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法,其特征在于:SSB位点被定义为序列2中12个T后的第一个碱基。

9.根据权利要求1至8任一项所述的一种非疾病诊断目的的检测DNA中的单链断裂的方法在双链断裂检测的非诊断目的用途。