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专利号: 2023107559415
申请人: 南京益纤生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2026-06-04
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种伊枯草菌素A抗菌脂肽,其特征在于:伊枯草菌素A抗菌脂肽的肽结构为:

2.一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤1:将保藏号为CGMCC No. 19541的枯草芽孢杆菌N‑2 接入豆粕半固态培养基富集得到菌液,以菌液混合豆粕和营养因子制成的固体发酵培养物进行发酵,获得发酵产物;

步骤2:将发酵产物离心,采用水提及酸沉淀法提取抗菌脂肽;

步骤3:采用两步法超滤进行脂肽的分离纯化,并利用反相高效液相色谱法进行测定,得到伊枯草菌素A抗菌脂肽。

3.根据权利要求2所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法,其特征在于:步骤1中所述豆粕半固态发酵培养基为:豆粕、LB培养基,LB培养基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L 氯化钠,其中豆粕和LB培养基的料液比5:1‑10:1,对培养基在121℃下灭菌20 min,接种量0.5%,温度27‑38℃,时间6‑12 h,获得菌液;

所述固体发酵培养物包括菌液5‑10%、豆粕、水、葡萄糖1‑2%、谷氨酸钠0.8‑1.8%、脯氨酸0.5‑1.5%、天冬氨酸0.5‑1.5%、KCl 0.1‑0.25%、(NH4)2SO4 0.1‑0.25%、Na2HPO4 0.05‑0.2 %,温度 27‑38℃,时间24‑60 h,其中豆粕和水的料液比5:1‑10:1。

4.根据权利要求3所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法,其特征在于:步骤2中水提及酸沉淀的过程为:发酵结束后,按照发酵底物:蒸馏水= 1:8‑1:10(w/v)加入蒸馏水,室温搅拌1‑2 h 后静置30‑60 min,4000 r/min离心20‑30 min后除去不溶物,上清用5 mol/L 盐酸调节pH至2.0‑2.5,4℃ 静置6 h后,4000 r/min低温离心20‑30 min获得沉淀,沉淀用甲醇按照1∶6 (w/v)复溶,萃取4 h后旋转蒸发除去甲醇获得脂肽提取物。

5.根据权利要求4所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法,其特征在于:所述步骤3中两步法超滤过程为:将步骤2中获得的脂肽提取物用超纯水按照 1:5‑1:12 (w/v) 复溶, 并用0.22μm微孔滤膜过滤去除杂质,滤过液使用分子量10 kDa超滤膜截留大分子物质,大分子物质包括脂肽胶束,截留物使用蒸馏水复溶,并加入等体积甲醇,用NaOH调节pH至6.0‑7.0后低温搅拌1.5‑3 h,随后用分子量10 kDa超滤膜收集分子量小于10 kDa的滤过液,再用冻干后即为纯化脂肽粉。

6.根据权利要求5所述的一种伊枯草菌素A抗菌脂肽的制备方法,其特征在于:所述步骤3中反相高效液相色谱测定的过程为:制备型液相柱,Agilent Zorbax SB‑Aq C18;

流动相含0.1 %甲酸的乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B);

洗脱模式,30% A (0 min)— 45% A (10 min)— 55% A (20min)—55% A (35 min);

流速5 mL/min,柱温30 °C,检测波长210 nm,所得伊枯草菌素A抗菌脂肽粉中伊枯草菌素纯度大于70%。