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专利号: 2021113558177
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:

S1.细胞样本处理:取对数生长期的人源结肠癌细胞,计数,调整混合溶液浓度后,接种至无菌培养皿中,每皿1mL,加入DMEM培养基2~6mL,37℃培养68~76h后,弃上清液后加入浓度为2~6mg/mL海藻多糖溶液2~6mL,37℃培养68~76h;吸出上清液,加入1~3mL胶原酶将细胞胶滴吹散,转移至离心管,加入2~6mLHBSS终止消化,离心处理后弃上清液,加入0.5~1.5mL经预冷的PBS缓冲液清洗收集的细胞,离心处理后弃上清液;将收集的细胞用经预冷的PBS缓冲液速冻后,再低温保存;

S2.细胞样本提取:取出细胞样本,缓慢解冻后,加入经预冷的提取剂,涡旋混合,2~6℃超声后静置,进行离心处理,取上清液进行真空干燥;质谱分析时加入乙腈水溶液复溶,涡旋,进行离心处理,取上清液放入进样瓶中待检;

S3.代谢组学分析:对步骤S2得到的上清液进行代谢组学分析,采用超高效液相色谱串联质谱方法检测采集数据,分析细胞代谢物变化情况;

S4.筛选评价:以海藻多糖处理后的人源结肠癌细胞的特征代谢物谷氨酸作为生物标志物,根据其差异代谢情况筛选海藻多糖的抗结肠癌活性。

2.根据权利要求1所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法,其特征在于,步骤S1中,所述混合溶液中Collagen type 1:NaOH:10xDMEM:Advanced DMEM+细胞悬5

液的体积比例为42:5:1:52;调整混合溶液浓度至8×10个细胞/mL。

3.根据权利要求1所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法,其特征在于,步骤S1中,所述经预冷的PBS缓冲液在使用前需于‑20℃条件下进行预冷。

4.根据权利要求1所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法,其特征在于,步骤S1中,所述提及的两次离心处理的温度均为4℃,离心转速均为1000~1600rpm,离心处理时间均为2~5min。

5.根据权利要求1所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法,其特征在于,步骤S1中,所述将收集的细胞用经预冷的PBS缓冲液速冻具体为将收集的细胞用160μL经预冷的PBS缓冲液移至冻存管,迅速地放入液氮中,速冻20~40min;所述低温保存具体为于‑80℃冰箱进行低温保存。

6.根据权利要求1所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法,其特征在于,步骤S2中,所述提取剂为体积比为2:2:1的甲醇/乙腈/水溶液;所述提取剂在使用前的预冷温度为2~6℃。

7.根据权利要求1所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法,其特征在于,步骤S2中,所述提及的两次离心处理的温度为2~6℃,离心转速为12000~16000rpm,离心处理时间为12~20min。

8.如权利要求1‑7任一项所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法的应用,其特征在于,所述海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法用于筛选和评价海藻多糖的抗结肠癌活性。

9.如权利要求8所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法的应用,其特征在于,所述海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法用于筛选和评价长茎葡萄蕨藻多糖和螺旋藻多糖的抗结肠癌活性。

10.如权利要求8或9所述的海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法的应用,其特征在于,所述海藻多糖抗结肠癌活性的生物代谢标志物筛选方法用于研发海藻多糖来源的肿瘤抑制功能食品。