1.一种改造羰基还原酶立体选择性的方法,其特征在于所述羰基还原酶立体选择性按如下方法改造:1)通过蛋白质结晶或同源建模的方法获得待改造羰基还原酶的三维结构;
2)利用计算机辅助方法测定待改造羰基还原酶底物结合口袋的大小与形状,确定组成结合口袋的关键位点及氨基酸残基;所述底物为脂肪族酮酯;3)根据产物的构型确定待改造羰基还原酶的立体选择性,通过调整步骤2)结合口袋关键位点的氨基酸残基空间位阻或疏水性来调整待改造羰基还原酶结合口袋大小与形状,若产物的构型为R型,则将待改造羰基还原酶底物结合口袋形状调整为立方体,若产物的构型为S型,则将待改造羰基还原酶底物结合口袋形状调整为长方体,调整后的结合口袋大小均与产物匹配;4)根据步骤3)待调整位点的氨基酸残基设计突变文库,筛选获得立体选择性的羰基还原酶突变体。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述羰基还原酶具有Rossmann折叠且氨基酸序列长度为300-350个氨基酸。
3.一种利用权利要求1所述的方法制备的羰基还原酶突变体,其特征在于所述羰基还原酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第87位、第129位、第162位、第199位或第239位进行单突变或多突变获得的。
4.如权利要求3所述的羰基还原酶突变体,其特征在于所述羰基还原酶突变体为下列之一:(1)第87位谷氨酸突变为天冬氨酸或苯丙氨酸;(2)第129位丙氨酸突变为甘氨酸或半胱氨酸;(3)第239位缬氨酸突变为谷氨酰胺或天冬酰胺;(4)第162位苯丙氨酸突变为缬氨酸或天冬酰胺;(5)第F199苯丙氨酸突变为亮氨酸或酪氨酸;(6)第87位谷氨酸突变为天冬氨酸,第129位丙氨酸突变为半胱氨酸且第239位缬氨酸突变为天冬酰胺。
5.一种权利要求3所述羰基还原酶突变体在不对称还原脂肪族酮中的应用,其特征在于所述脂肪族酮酯为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯或4-氯乙酰乙酸乙酯。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述的应用方法为:将含羰基还原酶突变体基因的工程菌经发酵培养后的发酵液离心,收集湿菌体,以湿菌体或湿菌体经超声破碎且镍柱纯化的纯酶为催化剂,以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎且镍柱纯化的纯酶为辅助催化剂,以脂肪族酮酯为底物,以葡萄糖为辅底物,以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系,在35-40℃、400-600rpm条件下进行反应,反应结束,反应液分离纯化,获得手性化合物;当底物为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时,手性化合物为6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯;当底物为4-氯乙酰乙酸乙酯时,手性化合物为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述反应体系中,底物添加终浓度为10-20g/L,葡萄糖添加终浓度20-40g/L,所述催化剂与辅助催化剂的湿菌体以干重比1.0-5.0:1混合成混合菌体形式加入,催化剂和辅助催化剂用量以混合菌体总量干重计为5-12.5g DCW/L。
8.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含羰基还原酶突变体基因的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养10h,以体积浓度1.5-2.0%的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、200rpm培养2h,再向培养液中加入终浓度为0.10mM异丙基硫代半乳糖苷,28℃培养12h后,4℃、8000rpm离心10min,获得含羰基还原酶突变体的湿菌体。
9.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述葡萄糖脱氢酶基因GenBank NO.KM817194.1。