1.基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，包括支撑板及由样品端到手柄端依次设置于支撑板上的样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫，样品垫和金标垫上设有样品垫保护膜，吸水垫上设有手柄端保护膜，其特征在于：所述金标垫吸附胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，检测膜上的检测线T为盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA‑CL印迹，检测膜上的质控线C为抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb印迹；

所述盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA‑CL由以下方法制备得到：采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗‑牛血清白蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL、0.01mol/L的稀盐酸中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将

20mg牛血清白蛋白BSA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入到上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为BSA‑CL偶联物，分装后保存于‑20℃，待用于羊驼免疫或检测线印制；

所述抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb由以下方法制备得到：

(1)兔抗牛血清白蛋白多克隆抗体的制备：以弗氏完全佐剂乳化牛血清白蛋白BSA抗原，以200μg/只的剂量通过背部皮下多点注射2.0kg健康新西兰兔，进行首次免疫，间隔3周后，以弗氏不完全佐剂乳化BSA抗原分别进行第二次、第三次和第四次免疫，最后一次加强免疫2周后，采集酶联免疫吸附试验中效价最高的兔全血，以4000r/min离心20min分离高免血清；

(2)兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG的提取：以辛酸‑硫酸铵法从高免兔血清中提取IgG，取

2mL高免兔血清，向其中加入4mL、0.06mol/L、pH 5.0的乙酸钠缓冲液，以0.1mol/L的盐酸溶液调节至pH 4.5，于室温搅拌下，逐滴加入90μL辛酸，于4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀，在离心上清中加入1/10体积0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH 7.4，于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至其终质量浓度为45％，4℃静置2h，

10000r/min离心30min，弃上清，以0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液重悬沉淀，对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液透析后，收集所纯化的兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG，用于检测试纸质控线C印迹的印制；

所述胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb由以下方法制备得到：

(1)抗盐酸克伦特罗纳米抗体的制备

(1.1)盐酸克伦特罗‑卵清蛋白偶联物OVA‑CL的制备

采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗‑卵清蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于

4mL、0.01mol/L的盐酸溶液中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将20mg卵清蛋白OVA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为OVA‑CL偶联物，分装后保存于‑20℃，待用于纳米抗体筛选；

(1.2)羊驼免疫与采血

首免时，通过羊驼颈部淋巴结部位注射400μg的BSA‑CL与弗氏完全佐剂混合液，两周后，将BSA‑CL与弗氏不完全佐剂混合乳化，同上进行第二次免疫，共进行4次免疫，颈部静脉采血，以免疫印迹Western blot检测抗体，以OVA‑CL偶联物作为包被抗原建立的间接ELISA测定抗体效价，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，纯化mRNA，并经反转录合成第一链cDNA；

(1.3)噬菌体肽库的制备

利用特异扩增羊驼IgG2和IgG3重链抗体可变区的引物进行PCR反应，获得长度450bp的DNA片段，通过限制性内切酶Sac I和Spe I对目的基因进行酶切并将其克隆至pComb3XSS噬菌粒载体，连接产物电转化TG1感受态细胞得到可能包含编码羊驼全部重链抗体可变区基因的重组噬粒库，随机挑选20个单菌落，提取质粒进行双酶切鉴定，使用辅助噬菌体M13KO7感染上述细菌文库，以使细菌中的噬粒DNA包装成完整的噬菌体，完成噬菌体拯救，释放重组噬菌体，获得噬菌体展示文库，利用Western blot确定VHH‑pIII融合蛋白的表达，使用固相化的OVA蛋白和BSA蛋白对噬菌体文库进行预处理，再以固相化的OVA‑CL偶联物抗原筛选噬菌体展示库，筛选过程以5wt％BSA和5wt％OVA作封闭液，经过3‑5轮的“吸附‑洗脱‑扩增”过程，获得与CL小分子半抗原高特异性、高亲和力结合的重组噬菌体克隆；

(1.4)噬菌体文库VHH‑pIII蛋白表达的检测

将噬菌体文库与适量上样缓冲液混匀，煮沸15min后作为样品进行SDS‑PAGE，转移至PVDF膜，以辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体作为反应抗体于37℃反应1小时，通过增强型化学发光法曝光检测反应信号；

(1.5)阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定

以碳酸盐缓冲液将OVA‑CL偶联物抗原或OVA蛋白包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5wt％脱脂奶于37℃封闭2小时，以PBST溶液即PBS+0.05wt％Tween‑20洗涤三次，4℃条件下

3000r/min离心15min收集过夜培养的菌液上清，加入酶标板，37℃孵育1小时，之后加入辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体，37℃孵育1小时，加入TMB底物缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值；

(1.6)纳米抗体的原核表达与纯化

将最后一轮筛选得到的噬菌体感染TG1感受态细胞，挑取单菌落，提取噬粒DNA，进行双酶切分析，将阳性单菌落噬菌体粒进行测序，并对氨基酸序列进行比对分析，鉴别重复序列及重链抗体可变区标志性的半胱氨酸残基，获得两种重复序列，分别命名为VHH37和VHH64，将编码纳米抗体的DNA片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a‑VHH37和pET28a‑VHH64，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在15℃，以0.2mmol/L异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG诱导蛋白表达8小时，以Ni‑NTA亲和层析和分子排阻色谱纯化重组蛋白；

(2)纳米抗体的胶体金标记

(2.1)胶体金纳米颗粒的制备：向500mL洁净的锥形瓶中分别加入100mL超纯水和1mL 

1％w/v的氯金酸溶液，加热煮沸，在搅拌状态下迅速加入1mL新鲜配制的1％w/v柠檬酸钠溶液用作还原剂，煮沸3min时溶液颜色由黄色变为紫红色，再次煮沸2min后停止，待溶液冷却至室温，以超纯水将溶液体积补充至100mL，以0.2mol/LK2CO3调节pH至9.0，4℃避光保存；

(2.2)最适标记蛋白浓度的确定：取待标记的纳米抗体对20mmol/L、pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液于4℃过夜透析，在12孔微孔板中预先加入25μL超纯水，稀释待标记的纳米抗体，留超纯水对照孔，向各孔中加入125μL上述制备的胶体金纳米颗粒溶液，室温静置5min后向各孔中加入125μL、1mol/L的NaCl溶液，发现各孔颜色随纳米抗体浓度的降低而由红色变为蓝色，以颜色未变蓝的纳米抗体最高稀释度对应浓度的120％作为胶体金颗粒标记时的最适蛋白浓度；

(2.3)盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体的胶体金标记：取2mL稀释至最适标记浓度的纳米抗体，迅速加至10mL、pH 9.0的胶体金溶液并充分混匀，室温孵育10～15min，加入1/

10体积含10％w/v牛血清白蛋白BSA的20mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10～

15min，在4℃条件下，以15000g离心30min，弃上清，以含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，同上离心，弃上清，重复洗涤1次，以1mL含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，即为胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，4℃避光保存，用于金标垫的喷附。

2.根据权利要求1所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，其特征在于：所述抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb特异识别盐酸克伦特罗小分子的半抗原表位，且每个抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb仅提供单一结合位点用于结合单个盐酸克伦特罗小分子，较天然单抗mAb提供的抗原结合位点减半，当待测样品中不含盐酸克伦特罗小分子时，检测膜显现检测线T和质控线C两条红色条带“││”，当待测样品中含有盐酸克伦特罗小分子时只显现质控线C一条红色条带“│”，不显示检测线T，该检测试纸能够在待测样品中存在微量或痕量盐酸克伦特罗小分子半抗原时即阻断金标纳米抗体Nb与检测线上的BSA‑CL偶联物结合，阻止检测线T出现红色条带，显著提升了检测试纸检测的敏感性，进而能够实现对待测样品中盐酸克伦特罗小分子的高敏感性快速检测。

3.一种权利要求1‑2中任意一项所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的制备方法，其特征在于具体步骤为：(1)金标垫的制备

2

将玻璃纤维切成1.5×30cm的长条，置于XYZ 3000三维喷点仪平台上，展平并以压条固定，将胶体金标记的盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体溶液放于Airjet的贮存池中，利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm将上述溶液喷点于玻璃纤维，置于50℃干燥箱干燥30min后密闭保存备用；

(2)样品垫的制备

2

将玻璃纤维切割成1.5×30cm 的长条，置于含0.1mol/LNaCl、0.2％v/v Tween 20和

0.1％w/v叠氮钠的pH 7.4的PBS溶液中浸泡，置50℃干燥箱干燥30min后，密闭保存备用；

(3)检测膜的制备

2

切割硝酸纤维素膜即NC膜切成2.5×30cm的长条，展平后以压条固定，将BSA‑CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG分别放于XYZ 3000三维喷点仪的贮存池1和2中，利用Biojet1和Biojet2以1.0μL/cm分别将BSA‑CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG溶液喷点于检测膜中央，分别形成检测线T印迹和质控线C印迹，检测线T与质控线C相距0.5cm，置于室温自然干燥后，将检测膜密闭保存备用；

(4)吸水垫的制备

2

将吸水棉切割成2.5×30cm的长条，密闭保存备用；

(5)支撑板的制备

2

将双面胶贴于PVC塑料支撑板，切成7.5×30cm的长板，制备试纸支撑板；

(6)检测试纸的组装

将样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫等材料按特定排列方式粘贴在支撑板上，先将检测膜粘贴于支撑板中央，再将样品垫和金标垫依次粘贴于检测膜的样品端，然后将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，相邻层间重叠2mm，之后将粘贴好的试纸板置于压膜机上，真空压膜

5min，利用CM4000切割机将装配好的试纸板切成宽度为0.4cm的检测试纸条，密闭保存。

4.一种权利要求1‑2中任意一项所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的应用，其特征在于具体检测过程为：将盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液中的盐酸克伦特罗小分子在吸水垫的吸引作用下向硝酸纤维素膜扩散并最终渗透到滤纸层，在扩散过程中待测样品溶液水合金标纳米抗体Nb，金标纳米抗体Nb与待检盐酸克伦特罗小分子相结合，形成金标纳米抗体Nb‑CL半抗原复合物，结合过盐酸克伦特罗小分子的金标纳米抗体Nb不能再与检测膜上的检测线印迹物BSA‑CL结合，不能生成红棕色“|”条带，金标纳米抗体Nb继续向手柄端扩散，在检测膜上与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，即仅有质控线C显现红棕色标记“|”，同时检测线T不显色，表示待测样品溶液中含有盐酸克伦特罗小分子；当样品中不含盐酸克伦特罗小分子时，被待测样品溶液水化后的金标纳米抗体Nb在向硝酸纤维素膜扩散过程中，没有与CL结合，不形成金标纳米抗体Nb‑CL半抗原复合物，此时金标纳米抗体Nb与检测膜上的检测线印迹BSA‑CL结合，生成红棕色“|”标记，部分金标纳米抗体继续扩散，与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，形成两条红棕色阳性标记“||”，表示样品中不含有盐酸克伦特罗小分子，如果检测膜上没有红棕色标记显示或仅有检测线出现红棕色“|”标记，表明检测试纸已失效，需要使用新的检测试纸对待测样品溶液进行再次检测。