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专利号: 2018116452384
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种重组酮酸还原酶突变体,其特征在于所述酮酸还原酶突变体为下列之一:SEQ ID NO.2氨基酸序列127位的亮氨酸突变为异亮氨酸、SEQ ID NO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸、SEQ ID NO.2氨基酸序列第250位的丙氨酸突变为甘氨酸、SEQ ID NO.2氨基酸序列第127位亮氨酸突变为异亮氨酸且第244位亮氨酸突变为甘氨酸、SEQ ID NO.2氨基酸序列127位的亮氨酸突变为异亮氨酸且第250位的丙氨酸突变为甘氨酸、SEQ ID NO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸且第250位的丙氨酸突变为甘氨酸、SEQ ID NO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸+第250位的丙氨酸突变为甘氨酸+第245位亮氨酸突变为精氨酸。

2.一种权利要求1所述重组酮酸还原酶突变体的编码基因。

3.一种权利要求2所述重组酮酸还原酶突变体的编码基因构建的工程菌。

4.一种权利要求1所述重组酮酸还原酶突变体催化2-氧代-4-苯基丁酸制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述应用的方法为:以含重组酮酸还原酶突变体编码基因和葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体分离纯化获得的纯酶为催化剂,以2-氧代-4-苯基丁酸为底物,以葡萄糖为辅底物,以pH6.0-8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系,在25-60℃、200-700rpm条件下反应完全后,得到含有(R)-2-羟基-4-苯基丁酸的转化液,分离纯化,获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述催化剂用量以湿菌体干重计为2.5~

20DCW/L,所述底物加入浓度为1~250mM,所述辅底物与底物的物质的量之比为0.5-3:1。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述底物加入浓度为250mM时分批加入,所述分批加入是指先加入终浓度100mM底物,待其反应完全后再加入终浓度100mM底物,待底物反应完全后再加入终浓度50mM底物至反应完全。

8.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述湿菌体的制备方法:将含有酮酸还原酶突变体编码基因和葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌接种到含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基中,于37℃、180rpm条件下振荡培养8~10h,获得种子液;将种子液按体积浓度2%的接种量接入到50μg/mL链霉素的LB液体培养基中,于37℃、180rpm条件下振荡培养至OD600达到

0.4~0.8,加入IPTG至终浓度为0.1mM,于28℃、180rpm条件下振荡培养10~12h,离心,收集湿菌体并用生理盐水洗涤二次,即得湿菌体。

9.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述湿菌体分离纯化提取纯酶的方法为:将湿菌体以结合缓冲液重悬后,于4℃冰浴中,在40W条件下工作1s停1s进行超声破碎,12000rpm离心10min,得到的上清为粗酶液;将上清于结合缓冲液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后,再用缓冲液冲洗至无杂蛋白,随后以洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白,以透析缓冲液透析

24h,取截留液即获得所述纯酶;所述结合缓冲液是含500mM NaCl的50mM,pH8.0磷酸缓冲液;所述缓冲液为含500mM NaCl和25mM咪唑的50mM,pH8.0磷酸钠缓冲液;所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和500mM咪唑的50mM,pH8.0磷酸钠缓冲液;所述透析缓冲液为100mM,pH6.5磷酸缓冲液。