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专利号: 2017113916611
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2025-04-21
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法,其特征在于具体步骤如下:(1)金电极的预处理:将金电极在氧化铝粉末上打磨;后依次在超纯水、乙醇、超纯水中超声清洗2-3 min;清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化,扫描范围从-0.4 V至+1.5 V,扫描速度100mV/s,直到获得稳定的循环伏安曲线为止;将金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干;

(2)镊子结构的固定:将合成好的A1、A2、A3序列用10mM PBS缓冲液溶解,-20℃冰箱中保藏;将三条序列用PBS缓冲液稀释;将体系为100μL、浓度各为0.8μM的三条序列的溶液放在95℃恒温金属浴中加热5min,然后室温下反应2h;之后倒扣到金电极上,反应6h,使镊子结构在金电极表面上形成自组装单分子层;用2mM巯基己醇封闭电极4h;用清洗缓冲液淋洗电极,氮气吹干待用;

2+

10mM PBS缓冲液中含有1mM Mg 、1M NaCl,其pH为7.4;

(3)镊子结构、目标DNA以及发卡结构之间的杂交反应:将修饰有镊子结构的电极浸没到100μL的反应体系中,室温反应2h;

所述反应体系为:0.6μM发卡结构、不同浓度的目标DNA、60U的核酸外切酶III,及10mM PBS缓冲液;

(4)G-四链体-血红素复合物的形成:将200μL的G-四链体形成液倒扣在如步骤(3)所述反应后的电极上,室温下30min;向G-四链体形成液中加入2μL 20 mM血红素混匀;将反应液继续倒扣到电极上,室温下1h;用清洗缓冲液冲洗电极,用于电化学检测;

所述G-四链体形成液为:10 mmol•L-1 HEPES, 50 mmol•L-1 KCl, pH8.0;

(5)电化学检测:采用三电极系统,上述金电极作为工作电极,Ag/AgCl作为参比电极,铂丝作为对电极;检测所用电解液为含20mM KCl的pH 7.4、20 mM HEPES缓冲液;通入氮气至少30 min;

检测方法为差分脉冲伏安法DPV,扫描范围-0.6~-0.15 V,振幅50 mV;取不同浓度的目标DNA,以步骤(1)-(5)同样操作后对其进行检测,绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线。

2.根据权利要求1所述基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法,其特征在于:以K-ras基因片段作为目标DNA,其序列为:

5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CACAAG -3’ ;

设计发卡结构序列为:

5’- TCACTCCTTC TAGCTACGTC AAGGCACTCT TGCCTACGCC ACCAGCTCCA ACTTGTGGTA GTTGGAGCTG GTGGCGTAGG CAAGAGTGCC TTGACGA -3’;

设计A1序列为:

5’-HS-CCGACCGCAG GATCCTATAA CTTGACGTAG CTAGAAGGAG-3’;

设计A2序列为:

5’-GCTGGTGGCG TAGGCAAGAT ACATTTTACG CCTGGTGCC-SH -3’;

设计A3序列为:

5’-GGGTTGGGTT TTTATAGGAT CCTGCGGTCG GAGGCACCAG GCGTAAAATG TATTTGGGTA GGG -3’。