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专利号: 2017105435696
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种氨基转移酶,其特征在于所述氨基转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

2.一种权利要求1所述氨基转移酶在生物催化合成西他列汀中的应用。

3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述的应用以含有氨基转移酶编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂,以西他列汀前体酮为底物,以二甲基亚砜为助溶剂,以磷酸吡哆醛为辅酶,以异丙胺为辅底物,以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系,在温度30-45℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应,反应结束后,将反应液分离纯化,获得西他列汀;所述反应体系中,湿菌体用量为10~100g/L,底物终浓度为2~50g/L,二甲基亚砜体积终浓度为10-40%,磷酸吡哆醛终浓度0.5g/L,异丙胺终浓度10g/L。

4.一种权利要求1所述氨基转移酶突变体,其特征在于所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。

5.一种权利要求4所述氨基转移酶突变体在生物催化合成西他列汀中的应用。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述的应用为:以含有氨基转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂,以西他列汀前体酮为底物,以二甲基亚砜为助溶剂,以磷酸吡哆醛为辅酶,以异丙胺为辅底物,以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系,在温度30-45℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应,反应结束后,将反应液分离纯化,获得西他列汀;所述反应体系中,湿菌体用量为

10-100g/L,底物终浓度为2~50g/L,二甲基亚砜体积终浓度为10-40%,磷酸吡哆醛终浓度

0.5g/L,异丙胺终浓度10g/L。

7.如权利要求5所述的应用,其特征在于当突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示时,所述的应用为:以含有氨基转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂,以潜手性羰基化合物为底物,以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物,以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系,在温度

25-35℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应,反应结束后,将反应液提纯,获得西他列汀中间体,对西他列汀中间体进行Boc保护,然后用Boc的转氨产物合成西他列汀;所述反应体系中,湿菌体用量为10~100g/L,底物终浓度为2~60g/L,二甲基亚砜体积终浓度为10-40%,磷酸吡哆醛终浓度0.5g/L,异丙胺终浓度10g/L;所述底物为下列之一:

3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-

4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,

4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯或3-羰基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述分离纯化方法为:反应结束后,用浓盐酸将反应液pH调至1.5,加入硅藻土吸附细胞,搅拌20min,过滤,获得滤液a和滤渣a,向滤渣a中加入1M盐酸,搅拌20min,抽滤,获得滤液b和滤渣b;合并滤液a和滤液b,用二氯甲烷萃取一次,获得有机相a和水相a,有机相a用1M盐酸萃取,获得有机相b和水相b,合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节pH至12,再用二氯甲烷萃取,获得有机相c和水相c,水相c中再加入二氯甲烷萃取,获得有机相d和水相d,合并有机相c和有机相d并用饱和氯化钠水洗二次,加入无水硫酸钠干燥,抽滤去除硫酸钠,45℃下旋转蒸发,得到西他列汀;所述硅藻土用量以反应液体积计为0.18g/mL。

9.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含有氨基转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,37℃,

200rpm下培养12h,再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中,于37℃,150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,

28℃下诱导培养12h后,4℃、5000rpm离心20min,弃去上清液,收集沉淀,即获得所述的湿菌体。