1.一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法,其特征在于,包括以下步骤:首先,取斑马鱼组织,经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞,然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞,再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导,经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞;所述诱导是指用含有盐酸强力霉素的诱导型培养基对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导;所述传代培养是指用iPS培养基对挑克隆后的诱导性多能干细胞进行传代培养;
所述诱导型培养基包括以下成分:90%DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1%的青霉素/链霉素和10ng/ml bFGF;所述诱导型培养基中添加有浓度为2~4ug/mL的盐酸强力霉素;
所述iPS培养基包括以下成分:90%DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸0.1mMβ-巯基乙醇、1%的青霉素/链霉素、10ng/ml bFGF、0.5μMPD0325901、0.5μM ALK5inhibitor A-83-01、3μM GSK3βinhibitor CHIR99021和1000U/ml LIF;
所述斑马鱼组织为斑马鱼成体尾鳍;
所述用病毒感染斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括:将293T细胞接种于含有培养基A的培养皿中,按9μg TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP、6μg pSPAX2、3μgpMD2.G添加质粒,按照转染操作处理后放置于饱和湿度培养箱中转染,转染至少48h后进行病毒液的收集,病毒液经低温高速浓缩滤器过滤后添加入聚凝胺,然后将含有聚凝胺的病毒液感染斑马鱼成纤维细胞;所述培养基A的成分为90%DMEM、10%胎牛血清、1mM L-谷氨酰胺、
0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和1%的青霉素/链霉素。
2.根据权利要求1所述的诱导方法,其特征在于,所述经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括:取斑马鱼的尾鳍置于酒精溶液中漂洗,然后放入含双抗的磷酸盐缓冲液中反复漂洗,将漂洗后的尾鳍剪碎成组织块贴于含有双抗的磷酸盐缓冲液培养皿中,然后置于饱和湿度培养箱中培养,当组织块边缘发干时添加培养基A继续培养,48~72h后换液,当组织块迁出的成纤维细胞达到80~90%时,经胰酶进行消化处理后过滤除去组织块,将得到的斑马鱼成纤维细胞计数传代并冻存备用。
3.根据权利要求2所述的诱导方法,其特征在于,所述斑马鱼成纤维细胞计数传代是取第2~20代的斑马鱼尾鳍成纤维细胞。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的诱导方法,其特征在于,所述对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导的具体操作包括:将感染后的斑马鱼成纤维细胞重铺于培养皿中计数传代,用添加盐酸强力霉素的诱导型培养基进行诱导,诱导15~20d后细胞出现典型的诱导性多能干细胞克隆,此时采用机械法或者胰酶消化挑取生长状况良好的克隆消化成单细胞,然后接种于含有iPS培养基的feeder或明胶上,用胰酶传代扩增并冻存得到斑马鱼诱导性多能干细胞。
5.一种可用于如权利要求1-4中任一项所述诱导方法的诱导型培养基,其特征在于,包括以下成分:90%DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1%的青霉素/链霉素和10ng/ml bFGF;所述诱导型培养基中添加有浓度为2~4ug/mL的盐酸强力霉素。
6.一种可用于如权利要求1-4中任一项所述诱导方法的iPS培养基,其特征在于,包括以下成分:90%DMEM、7.5%胎牛血清、2.5%鱼血清、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸
0.1mMβ-巯基乙醇、1%的青霉素/链霉素、10ng/ml bFGF、0.5μM PD0325901、0.5μMALK5inhibitor A-83-01、3μM GSK3βinhibitor CHIR99021和1000U/ml LIF。