1.一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)设计一条报告探针DNA链S1,所述DNA链S1与溶菌酶适体S2互补配对;S1链的3’端修饰有二茂铁标记物,S1链的5’端硫醇化;其中,报告探针S1的DNA链序列为:5’-SH-C
6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-Fc-3’;适体S2的DNA链序列为:5’-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’;
(2)将金电极打磨抛光成镜面,再经二次蒸馏水超声清洗,干燥,得处理后的金电极;
(3)报告探针S1在含有三(2-羧乙基)膦的缓冲液中打开二硫键,后将溶菌酶适体S2加入与S1形成双链DNA;
(4)将步骤(2)处理好的金电极浸在步骤(3)得到双链DNA溶液中,将双链DNA修饰到金电极表面,得电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述DNA链S1自身有16个碱基长度的互补配对序列,在溶菌酶适体链S2脱离后形成颈环结构。
3.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨;超声清洗的时间为20~60s;干燥为氮气吹干。
4.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述缓冲液为含有90~110mM Tris-HCl,90~110mM NaCl,9~11mM三(2-羧乙基)膦的混合液,其pH为7.2~7.6。
5.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中S1的浓度为1~2uM,S2的浓度为1~2uM。
6.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,双链DNA形成条件为:混合液于90℃加热4~6分钟,37℃反应2~3小时。
7.如权利要求1所述的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,电极浸入双链DNA溶液的时间为20~24小时。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法制备的一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器。
9.如权利要求8所述的电化学生物传感器在检测溶菌酶中的应用,其特征在于,检测步骤如下:(1)将上述传感器在三氯化六氨合钌检测液中浸泡,然后与甘汞参比电极和铂丝对比电极构成三电极系统,进行SWV检测,得到钌的峰电流I0(RuHex),二茂铁的峰电流为I0(Fc);
(2)将该电化学生物传感器与不同浓度的溶菌酶进行识别后用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测,将得到的三氯化六氨合钌的峰电流与步骤(1)得到的I0(RuHex)做差取绝对值得:|△IRuHex|=|IRuHex-I0(RuHex)|,同样方法处理将得到|△IFc|;以|△IRuHex|+|△IFc|对溶菌酶浓度做线性回归方程,得工作曲线;
(3)在对实际样品进行检测时,采用同样方法对待测样品中的溶菌酶进行SWV检测,将得到两个峰电流分别与对应I0做差、取绝对值、加和后代入线性回归方程即得样品中溶菌酶的浓度。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,三氯化六氨合钌检测液为pH为7.4的含有100mM Tris-HCl、140mM NaCl、5mM MgCl2、10μM RuHex的混合液;所述浸泡时间为5~6分钟。