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专利号: 2015102828228
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A,其特征在于,化学式为C96H175N2O35P,其结构包含2个α-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸、2个氨基葡萄糖、1个磷酸基团和5条脂肪酸链,是以β-(1’-6)连接的D-葡萄糖胺二糖为骨架,6’位连接二α-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸,4’位被磷酸化,2’位氨基连接(R)-3-(十二烷氧基)十四烷基,

3’位、3位和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成。

2.一种产低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的大肠杆菌基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌的基因型为E.coli W3110△waaCF△lacI△lpxMlacZ::FnlpxE。

3.一种构建权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)将人工构建的lacI敲除片段转化入E.coli W3110/pKD46感受态细胞中,获得突变株E.coli W3110lacI::Pkan,通过Cre酶介导的loxP位点特异性重组去除卡那霉素抗性基因;

2)FnlpxE片段电转入步骤1)制备的E.coli W3110△lacI/pKD46感受态细胞中,获得重组菌,其基因型为E.coli W3110△lacIlacZ::FnlpxE-Fkan,通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因,构建成中间菌株HW001;

3)在HW001突变株的基础上转入人工构建的lpxM敲除片段转化入HW001/pKD46感受态细胞中,获得重组菌E.coli W3110△lacIlacZ::FnlpxE lpxM::Pkan,再次通过Cre酶介导的loxP位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因,构建成中间菌株HW002;

4)在HW002突变株的基础上将人工构建的waaCF敲除片段转化入HW002/pKD46感受态细胞中,获得重组菌E.coli HW002waaCF:Pkan,再次通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因,最终基因型为E.coli W3110△waaCF△lpxM△lacIlacZ::FnlpxE,构建成基因工程菌株BW002。

4.一种应用权利要求2所述大肠杆菌基因工程菌生产低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)摇瓶发酵培养菌体,(2)收集菌体,氯仿/甲醇/水混合相体系提取分离单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2-类脂,(3)DEAE纤维柱纯化单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2-单磷酸类脂A。

5.权利要求1所述单磷酸五条脂肪酸链的减毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的应用。

6.权利要求1所述单磷酸五条脂肪酸链的减毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A在制备疫苗佐剂中的应用。

7.权利要求2所述大肠杆菌基因工程菌在在制备疫苗佐剂中的应用。