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专利号: 2024115789593
申请人: 广州浦光医疗科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:授权未缴费
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-02-21
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种NK细胞的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)NK细胞的分离与纯化:首先从外周血中使用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC,然后将分离的PBMC悬浮于RPMI培养基中,用免疫磁珠进行NK细胞纯化;

所述免疫磁珠标记同时结合CD56和CD16的抗体,其中同时结合CD56和CD16的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;

所述同时结合CD56和CD16的抗体特异性结合CD56蛋白的位置为aa323-aa340,其氨基酸序列为EQVTLTCEASGDPIPSIT;

所述同时结合CD56和CD16的抗体特异性结合CD16蛋白的位置为aa21-aa38,其氨基酸序列为DSVTLKCQGAYSPEDNST;

(2)NK细胞在低氧环境下的初步扩增:将步骤(1)中纯化的NK细胞以1×10^6 cells/mL的浓度接种于无血清培养基中,将其放置在5% O2、37℃的低氧培养箱中进行培养;每2天更换50%无血清培养基,保持NK细胞浓度在2×10^6 cells/mL左右,持续培养5天;

所述无血清培养基的配方为:

基础培养液:RPMI-1640,其占NK细胞无血清培养液体积比为50%;

氨基酸:L-谷氨酰胺2 mM;

葡萄糖:25 mM;

维生素:维生素C 100 µM;

化学小分子:二甲双胍 1 mM;

细胞因子:IL-2 20 ng/mL,IL-15 50 ng/mL,IL-21 20 ng/mL;

牛磺酸:100 µM;

(3)NK细胞的共培养:在步骤(2)培养后的NK细胞中加入肿瘤相关抗原刺激,其浓度为10 μg/mL,同时将无血清培养基中的IL-2浓度提高至50 ng/mL,所述肿瘤相关抗原为MUC1蛋白、CEA蛋白、HER2蛋白等质量比混合的总蛋白;继续在低氧条件下共培养3天,收集NK细胞;

(4)NK细胞的持续扩增与收获:对步骤(3)共培养后的NK细胞继续低氧培养,同时将无血清培养基中的IL-2浓度提高至100 ng/mL;每2天更换50%培养基,保持NK细胞浓度在2×10^6 cells/mL左右,持续培养7天,收集NK细胞,即为制备的NK细胞,将其进行冻存备用。

2.一种如权利要求1所述的方法在制备NK细胞中的应用。