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专利号: 2022106719198
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2025-12-24
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽,其特征在于所述激动肽的序列为:

Pro‑Ser‑Arg‑Ile‑Leu‑Tyr‑Gly,该激动肽有显著的抗氧化活性,能激活Nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。

2.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

a)酶解:取龙头鱼骨胶原蛋白,加入蒸馏水中混合均匀,利用木瓜蛋白酶进行酶解,pH8.0、温度55℃,水解4h,酶解完成后水浴煮沸10min灭活,离心取上清液调节pH至中性;

b)过滤:将酶解液经过0.22μm滤膜过滤,再利用分子量为1kDa超滤膜过滤,将滤液冷冻干燥,得冻干粉;

c)Sephadex G‑15凝胶层析:将90mg的步骤b)中的冻干粉溶于3mL蒸馏水中,上Sephadex G‑15凝胶柱进行分离,洗脱液为蒸馏水,洗脱液流速为0.3mL/min,每管收集时间为3min,每100管为一个循环,将试管中收集的洗脱液置于微量比色皿中,于280nm波长处测定紫外吸收值,合并吸光值最强的几管收集液,冷冻干燥,测定各峰DPPH·清除率,选取清除活性最高的成分进行后续分离;

d)全自动高压制备分离:将步骤c)中活性最高的组分配成1mg/mL的溶液,用0.22μm滤膜过滤,流动相为水和乙腈(含0.1%三氟乙酸),乙腈的洗脱梯度为10%~95%,进样量为

5mL,流速为3.0mL/min,洗脱时间为90min,检测波长设置为215和280nm;收集洗脱峰,冷冻干燥;通过LC‑MS/MS分析确定所得的寡肽序列为Pro‑Ser‑Arg‑Ile‑Leu‑Tyr‑Gly。

3.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽的制备方法,其特征在于所述步骤a)中所述鱼胶原蛋白的制备包括以下步骤:将鱼骨剪碎,除去非胶原物质、脱钙处理、去脂肪处理及提取鱼胶原蛋白步骤。

4.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽的制备方法,其特征在于所述步骤a)中所述鱼胶原蛋白的制备包括以下步骤:将处理好的鱼骨剪碎,按1:20(g/ml)的料液比用0.1mol/L NaOH溶液搅拌鱼骨48h,中间换液4次,用来除去非胶原物质,蒸馏水洗至中性;接着按1:20(g/ml)的料液比将鱼骨浸泡于浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐溶液中搅拌48h进行脱钙处理,中途换液4次,处理完后清洗数遍;然后按1:20(g/ml)的料液比用15%的异丙醇溶液搅拌鱼骨直至除去鱼骨中的脂肪,然后将异丙醇清洗干净,整个实验过程均在4℃下进行;按1:30(g/ml)料液比加入0.5mol/L乙酸溶液(含重量比0.5%的胃蛋白酶)在4℃搅拌一天提取鱼骨胶原蛋白,提取结束后用脱脂棉纱布过滤,按上述方法反复提取两次,合并滤液;向滤液中加入NaCl溶液进行盐析并不断搅拌至无沉淀洗出,将悬浊液在4℃、12000r/min的条件下离心,离心管底部的沉淀复溶于0.5mol/L乙酸溶液,最后装入透析袋透析至中性,冷冻干燥,制得鱼胶原蛋白。

5.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽的制备方法,其特征在于所述步骤a)中龙头鱼骨胶原蛋白与蒸馏水的重量体积比g/ml为8:500。

6.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽的制备方法,其特征在于所述步骤a)中木瓜蛋白酶的添加量为5500U/g。

7.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽的制备方法,其特征在于所述步骤c)中冻干粉与蒸馏水的重量体积比mg/ml为30:1。