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专利号: 2022102571577
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种从豌豆蛋白中筛选DPP‑IV抑制肽的方法,其特征在于,主要包括以下步骤:(1)利用蛋白酶水解豌豆蛋白产生豌豆肽;

(2)将步骤(1)所得豌豆肽用色谱进行分离,选择具有相对高的抑制DPP‑IV能力的部分进行下一步的测序;

(3)通过多肽组学对步骤(2)分离得到的部分豌豆肽进行测序;

(4)利用分子对接技术从步骤(3)测序得到的豌豆肽中筛选高活性的DPP‑IV抑制肽。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,主要包括以下步骤:(1)利用蛋白酶水解豌豆蛋白产生豌豆肽

将豌豆蛋白粉与水混合,加热使豌豆蛋白受热变性,然后添加蛋白酶对豌豆蛋白进行水解,水解结束后,将豌豆蛋白水解液加热灭酶,然后冷却、离心,取上清冻干;

(2)将步骤(1)所得冻干物经Sephadex G‑15进行分离,选择具有相对高的抑制DPP‑IV能力的部分进行下一步的测序;

(3)通过多肽组学对步骤(2)分离得到的部分豌豆肽进行测序;

(4)利用分子对接技术从步骤(3)测序得到的豌豆肽中筛选高活性的DPP‑IV抑制肽。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述豌豆蛋白粉是指去除豌豆中的淀粉与脂肪后的干燥的蛋白粉末。

4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述蛋白酶是复合蛋白酶,能够切割豌豆蛋白的多个位点。

5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(1)采用如下实施条件:将豌豆蛋白粉与蒸馏水按1:20的比例混合,预热以确保豌豆蛋白完全受热变性;待豌豆蛋白溶液冷却至室温后,添加复合蛋白酶于pH 7.0、55℃条件下水解;在水解过程中,维持溶液的pH值恒定;水解后,将豌豆蛋白水解液煮沸灭酶;待冷却至4℃,离心、取上清并冻干后于‑20℃保存,以备下一步分离纯化。

6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(2)将60mg冻干后的豌豆蛋白水解液的上清冻干物分散于3mL去离子水中,过0.45μM滤膜,用Sephadex G‑15柱分离;以流速

30mL/h的超纯水洗脱,每管收集3mL洗脱馏分,选择DPP‑IV抑制活性高的馏分用于进一步的测序分析。

7.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(4)采用如下步骤:①DPP‑IV酶PDB文件准备:从蛋白质数据库中检索DPP‑IV酶的蛋白质晶体结构,从1WCY中去除多余的配体diprotin A与H2O以便进行后续的对接实验;

②测序后的多肽依次与1WCY对接后获得Vina Score,DPP‑IV结合位点被定义为包含15个 以内的蛋白质残基的球体;

③根据Vina Score筛选结合能较低的多肽,并将已公开序列的DPP IV抑制肽排除,剩余的多肽确定为潜能DPP IV抑制肽,通过体外固相合成并验证其DPP IV抑制活性。

8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述结合能的值越低表示相应多肽的DPP‑IV抑制活性越强。

9.DPP‑IV抑制肽,其特征在于,氨基酸序列是IPYWTY、IPYWT、LPNYN或LAFPGSS。

10.权利要求9所述DPP‑IV抑制肽在制备DPP‑IV抑制剂、制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。