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专利号: 2022102469615
申请人: 沈阳农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的特异性引物,其特征在于:根据中华小长臂虾微孢子虫的靶基因序列,合成扩增片段大小为141bp的上下游引物,所述引物的序列如下:上游引物为:5’‑ATTCCCTCGTTCGTTGAGTCAGATTG‑3’,下游引物为:5’‑GTGGCATTGTCATCATCCCTTTGTTG‑3’,引物浓度有要求为10μM/μL。

2.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的上下游引物以及中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品。

3.根据权利要求1所述的用于中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测的试剂盒,其特征在于:所述中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品由Eb99F/Eb99R引物进行扩增得到目的片段制备而成,‑20℃保存。

4.如权利要求1‑2任一项所述的引物在中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测中的应用。

5.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法,其特征在于:绝对荧光定量PCR方法的建立:使用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂进行绝对荧光定量PCR方法的建立,反应体系为20μL,2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μL,上下游引物各0.4μL,ddH2O 7.2μL,模板2μL;加样时先将引物和ddH2O均匀混合并分装到反应管,后加均匀混合好的模板和2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,上机器前离心处理;

反应条件为:预变性95℃30s,1个循环;变性95℃10s,退火60℃30s,延伸72℃30s,40个循环。

6.根据权利要求5所述的一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法,其特征在于:所述荧光定量PCR标准曲线的绘制:(1)制备含扩增靶序列的阳性质粒作为阳性标准品;

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(2)将构建标准重组质粒换算拷贝数后,进行连续的10倍梯度稀释,从7.7×10到7.7×8

10共设置9个浓度梯度,每个梯度设置6个重复,于荧光定量PCR仪中进行扩增,各取2μL当做模板,同时设置以ddH2O为模板为阴性对照;

(3)扩增结束后收集数据,根据扩增屈曲线、Ct值,每个浓度重复3次进行检测,得出最佳的检测区间,并绘制标准曲线。