1.一种具包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia及Pii抗病基因家族等位基因的方法,其特征在于,该方法由2套自成体系的“抗病功能性单倍型‑抗病等位基因”两级检测标记组成,并各自逐级推进;供试品种是否携带目标基因由各套方法检测的综合结果而独立决定;
具体地,所述方法包含:
(1)一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的方法包含:(a)该基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:
通过家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;
设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;
(b)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pia‑C的检测程序:基因Pia‑C序列如GenBankOL773678及OL773679所示;
通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个功能特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pia‑C基因携带者属于Pia抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pia‑C参考品种的基因型相同的品种;反之,任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pia‑C;
(2)一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因的方法包含:(c)该基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:
通过基因家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;
(d)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑F的检测程序:基因Pii‑F序列如GenBank MH490982.1及MH490983.1所示;
通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个功能特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pii‑F基因携带者属于Pii抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pii‑F参考品种的基因型相同的品种;反之,任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pii‑F;
(e)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑M的检测程序:基因Pii‑M序列如GenBank EU869185.1及EU869186.1所示;
通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个功能特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pii‑M基因携带者属于Pii抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pii‑M参考品种的基因型相同的品种;反之,任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pii‑M;
上述方法中:
G1‑303T Indel(2‑1007)
(a)中单倍型特异性分子标记组合为Pia‑F/N 及Pia‑F/N ;其序列分别为SEQ ID NO.1~2和SEQ ID NO.3~4所示;
其中,标记说明:F/N,功能性functional/非功能性non‑functional;上标G1‑303T意为位于Pia成对基因之#1基因之#303位置的特异性SNP;上标Indel(2‑1007)意为位于Pia成对基因之#2基因之#1007位置的特异性插入/缺失多态性,如此类推;
T1‑2214C Indel(2‑3038)
(b)中目标基因特异性分子标记组合为Pia‑C 及Pia‑C ;其序列分别为SEQ ID NO.5~8和SEQ ID NO.9~10所示;
T1‑2214C
其中,Pia‑C 标记需要2条正向引物与2条反向引物配对才能确保其稳定性及可靠性;
Indel(1‑1333) Indel(2‑1323)
(c)中目标基因特异性分子标记组合为Pii‑F/N 及Pii‑F/N ;其序列分别为SEQ ID NO.11~12和SEQ ID NO.13~16所示;
Indel(2‑1323)
其中,Pii‑F/N 标记需要2条正向引物与2条反向引物配对才能确保其稳定性及可靠性;
G1‑4603A C1‑5687T
(d)中目标基因特异性分子标记组合为Pii‑F 及Pii‑F ;其序列分别为SEQ ID NO.17~18和SEQ ID NO.19~20;
T1‑4591C A2‑1832C
(e)中目标基因特异性分子标记组合为Pii‑M 及Pii‑M ;其序列分别为SEQ ID NO.21~22和SEQ ID NO.23~24。
2.权利要求1所述方法的应用,其特征在于,应用于在上述2个复杂的稻瘟病抗病基因家族中对新旧等位基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于,应用于在上述2个复杂的稻瘟病抗病基因家族中对新旧等位基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘如下6个目标基因:稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pia‑C,其成对基因的序列如GenBank OL773678及OL773679所示;
稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pia‑A,其成对基因的序列如GenBank AB604626.1及AB604621.1所示;
稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑F,其成对基因的序列如GenBank MH490982.1及MH490983.1所示;
稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之抗病等位基因Pii‑M,其成对基因的序列如GenBank EU869185.1及EU869186.1所示;
稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑BJ,其成对基因的序列如GenBank OL689231及OL689232所示;
稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑F036,其成对基因的序列如GenBank OL689233及OL689234所示。
4.权利要求1所述方法的应用,其特征在于,利用Pia基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测原理及程序,甄别并推断该基因家族存在整体性测序错误的应用。
5.权利要求1所述方法的应用,其特征在于,利用具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pia抗病基因家族等位基因的方法,甄别该基因家族真假抗病等位基因的应用。
6.权利要求1所述方法的应用,其特征在于,应用于在未知目标基因的种质资源中,分别鉴定上述2个基因家族的已知目标基因。
7.根据权利要求6所述应用,其特征在于,以及挖掘新型的目标基因:稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pia‑C,其成对基因的序列如GenBank OL773678及OL773679所示。
8.根据权利要求6所述应用,其特征在于,以及挖掘新型的目标基因:稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑BJ,其成对基因的序列如GenBank OL689231及OL689232所示。
9.根据权利要求6所述应用,其特征在于,以及挖掘新型的目标基因:稻瘟病Pii抗病基因簇之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑F036,其成对基因的序列如GenBank OL689233及OL689234所示。
10.权利要求1所述方法的应用,其特征在于,应用于挖掘并克隆3个新型的抗病等位基因及其序列在植物抗病育种计划中的应用:稻瘟病Pia‑C抗病基因家族等位基因之成对基因的克隆引物序列为SEQ IDNO.25~26及SEQ ID NO.27~28所示;
稻瘟病Pia抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pia‑C,序列如GenBankOL773678及OL773679所示;
稻瘟病Pii抗病基因家族等位基因之成对基因的克隆引物序列为SEQ ID NO.29~30及SEQ ID NO.31~32所示;
稻瘟病Pii抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑BJ,其成对基因的序列如GenBank OL689231及OL689232所示;
稻瘟病Pii抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pii‑F036,其成对基因的序列如GenBank OL689233及OL689234所示。