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专利号: 2021114746741
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种根茎类中药材LAMP组合检测引物,其特征在于,包括:Fusarium oxysporum的LAMP引物:正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP及正向环引物LF;

Fusarium solani的LAMP引物:正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF及反向环引物LB;

Mucor circinelloides的LAMP引物:正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF及反向环引物LB;

Athelia rolfsii的LAMP引物:正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP及反向内引物BIP;

上述引物的具体基因序列如表2所示。

2.权利要求1所述的根茎类中药材LAMP组合检测引物用于制备检测根茎类中药材根腐病及白绢病试剂盒的应用。

3.一种根茎类中药材LAMP组合检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒中包含权利要求1所述的LAMP组合检测引物。

4.根据权利要求3所述的根茎类中药材LAMP组合检测试剂盒,其特征在于,包含:Fusarium oxysporum的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,0.8μM正向环引物LF,1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase;

Fusarium solani的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,0.8μM正向环引物LF,0.8μM反向环引物LB,1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase;

Mucor circinelloides的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,

1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,1.6μM正向环引物LF,0.8μM反向环引物LB,

1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase;

Athelia rolfsii的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase。

5.根据权利要求4所述的根茎类中药材LAMP组合检测试剂盒,其特征在于,包括检测系统:

①提取待检Fusarium oxysporum的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μLFusarium oxysporum的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和68℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察;

②提取待检Fusarium solani的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μL Fusarium solani的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和67℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察;

③提取待检Mucor circinelloides的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μL Mucor circinelloides的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和60℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察;

④提取待检Athelia rolfsii的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μL Athelia rolfsii的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和62℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察。

6.根据权利要求3所述的根茎类中药材LAMP组合检测试剂盒,其特征在于,包含:Fusarium oxysporum的检测:包括提取待检测微生物的DNA,以提取的DNA为模板,利用所述的Fusarium oxysporum的LAMP引物进行检测,显色剂为二甲酚橙,黄色表示检测为阳性,存在Fusarium oxysporum;紫红色表示检测结果为阴性,不存在Fusarium oxysporum;

Fusarium solani的检测:包括提取待检测微生物的DNA,以提取的DNA为模板,利用所述的Fusarium solani的LAMP引物进行检测,显色剂为二甲酚橙,黄色表示检测为阳性,存在Fusarium solani;紫红色表示检测结果为阴性,不存在Fusarium solani;

Mucor circinelloides的检测:包括提取待检测微生物的DNA,以提取的DNA为模板,利用所述的Mucor circinelloides的LAMP引物进行检测,显色剂为二甲酚橙,黄色表示检测为阳性,存在Mucor circinelloides;紫红色表示检测结果为阴性,不存在Mucor circinelloides;

Athelia rolfsii的检测:包括提取待检测微生物的DNA,以提取的DNA为模板,利用所述的Athelia rolfsii的LAMP引物进行检测,显色剂为二甲酚橙,黄色表示检测为阳性,存在Athelia rolfsiii;紫红色表示检测结果为阴性,不存在Athelia rolfsii。

7.一种根茎类中药材LAMP检测方法,其特征在于,包括:Fusarium oxysporum的检测:以待检微生物的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的Fusarium oxysporum的LAMP引物进行LAMP反应,显色剂为二甲酚橙,然后观察扩增产物的颜色变化,如果颜色由紫色变为黄色,表示待检物中存在病原菌Fusarium oxysporum,如果颜色没有变化仍是紫色,表示待检物中不存在病原菌Fusarium oxysporum;

Fusarium solani的检测:以待检微生物的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的Fusarium solani的LAMP引物进行LAMP反应,显色剂为二甲酚橙,然后观察扩增产物的颜色变化,如果颜色由紫色变为黄色,表示待检物中存在病原菌Fusarium solani,如果颜色没有变化仍是紫色,表示待检物中不存在病原菌Fusarium solani;

Mucor circinelloides的检测:以待检微生物的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的Mucor circinelloides的LAMP引物进行LAMP反应,显色剂为二甲酚橙,然后观察扩增产物的颜色变化,如果颜色由紫色变为黄色,表示待检物中存在病原菌Mucor circinelloides,如果颜色没有变化仍是紫色,表示待检物中不存在病原菌Mucor circinelloides;

Athelia rolfsii的检测:以待检微生物的基因组DNA为模板,以权利要求1所述的Athelia rolfsii的LAMP引物进行LAMP反应,显色剂为二甲酚橙,然后观察扩增产物的颜色变化,如果颜色由紫色变为黄色,表示待检物中存在病原菌Athelia rolfsii,如果颜色没有变化仍是紫色,表示待检物中不存在病原菌Athelia rolfsii。

8.根据权利要求7所述的根茎类中药材LAMP检测方法,其特征在于,包括:①提取待检Fusarium oxysporum的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μLFusarium oxysporum的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和68℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察;

②提取待检Fusarium solani的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μL Fusarium solani的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和67℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察;

③提取待检Mucor circinelloides的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μL Mucor circinelloides的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和60℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察;

④提取待检Athelia rolfsii的DNA,取1μL DNA溶液,加入24μL Athelia rolfsii的LAMP检测溶液进行LAMP反应,LAMP反应程序为:70℃1min和62℃60min,扩增产物进行颜色变化的观察。

9.根据权利要求7或8所述的根茎类中药材LAMP检测方法,其特征在于,提取待检微生物DNA的方法包括:

①0.3g土壤和0.2g直径为1mm的磁性玻璃珠混合后,加入250μL的提取液,4 000r/min旋涡振荡1min;

②再加入150mL氯化苄振荡混匀,60℃金属浴15min,获得悬浮液;

③悬浮液中加入3mol/L醋酸钠150μL,轻微振荡混合,于冰上放置15min;15000r/min离心10min后收集上清液;

④对获得的上清液进行纯化获得DNA,于‑80℃保存备用。

10.根据权利要求8所述的根茎类中药材LAMP检测方法,其特征在于,检测溶液包括:Fusarium oxysporum的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,0.8μM正向环引物LF,1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase;

Fusarium solani的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,0.8μM正向环引物LF,0.8μM反向环引物LB,1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase;

Mucor circinelloides的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,

1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,1.6μM正向环引物LF,0.8μM反向环引物LB,

1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase;

Athelia rolfsii的LAMP检测溶液:0.2μM正向外引物F3,0.2μM反向外引物B3,1.6μM正向内引物FIP,1.6μM反向内引物BIP,1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙,0.8M甜菜碱,8mM MgS04,0.32U/μL Bst DNA polymerase。