1.一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的技术体系,所述稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因包括Pid‑2,Pid‑3,Pid‑4,其特征在于,该技术体系由3套自成体系的“功能性单倍型‑抗病等位基因”等二级检测标记组成,并各自逐级推进;供试品种是否携带目标基因由各套技术体系检测的综合结果而独立决定;
具体地,所述技术体系包含:
(1)一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid‑2抗病基因家族等位基因的技术体系包含:
(a)Pid‑2基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;原则上,在后续的检测中,非功能性品种可被排除;
(b)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2‑DIG的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计1个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid2‑DIG基因携带者应该属于Pid‑2抗病基因家族之功能性单倍型,而且该功能特异性分子标记之基因型与Pid2‑DIG参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid2‑DIG;
(c)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2‑ZS的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计1个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid2‑ZS基因携带者应该属于Pid‑2抗病基因家族之功能性单倍型,而且该功能特异性分子标记之基因型与Pid2‑ZS参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid2‑ZS;
(2)一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid‑3抗病基因家族等位基因的技术体系包含:
(d)Pid‑3基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;原则上,在后续的检测中,非功能性品种可被排除;
(e)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑DIG的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid3‑DIG基因携带者应该属于Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3‑DIG参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid3‑DIG;
(f)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑TTP的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid3‑TTP基因携带者应该属于Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3‑TTP参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid3‑TTP;
(g)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑ZS的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid3‑ZS基因携带者应该属于Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3‑ZS参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid3‑ZS;
(3)一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid‑4抗病基因家族等位基因的技术体系包含:
(h)Pid‑4基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;原则上,在后续的检测中,非功能性品种可被排除;
(i)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑DIG的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid4‑DIG基因携带者应该属于Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4‑DIG参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid4‑DIG;
(j)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑NPB的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid4‑NPB基因携带者应该属于Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4‑NPB参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid4‑NPB;
(k)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑SN的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记组合;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid4‑SN基因携带者应该属于Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4‑SN参考品种的基因型相同的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid4‑SN。
2.根据权利要求1所述技术体系,其特征在于:C1022T A1383G
(a)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为Pid2‑F/N 及Pid2‑F/N ;
其序列分别为SEQ ID NO.1~2和SEQ ID NO.3~4所示;
T2058C
(b)中最优的目标基因Pid2‑DIG特异性分子标记为Pid2‑DIG ;其序列为SEQ ID NO.5~6所示;
A555G
(c)中最优的目标基因Pid2‑ZS特异性分子标记为Pid2‑ZS ;其序列为SEQ ID NO.7~8所示;
G2009A C2209T
(d)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为Pid3‑F/N 及Pid3‑F/N ;
其序列分别为SEQ ID NO.9~10和SEQ ID NO.11~12所示;
G775A G2695A
(e)中最优的目标基因Pid3‑DIG特异性分子标记为Pid3‑DIG 及Pid3‑DIG ;其序列分别为SEQ ID NO.13~14和SEQ ID NO.15~16所示;
C1136T C1623G
(f)中最优的目标基因Pid3‑TTP特异性分子标记为Pid3‑TTP 及Pid3‑TTP ;其序列分别为SEQ ID NO.17~18和SEQ ID NO.19~20所示;
G477A C525T
(g)中最优的目标基因Pid3‑ZS特异性分子标记为Pid3‑ZS 及Pid3‑ZS ;其序列分别为SEQ ID NO.21~22和SEQ ID NO.23~24所示;
C1217G A1452G
(h)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为Pid4‑F/N 及Pid4‑F/N ;
其序列分别为SEQ ID NO.25~26和SEQ ID NO.27~28所示;
A1149T A1898G
(i)中最优的目标基因Pid4‑DIG特异性分子标记为Pid4‑DIG 及Pid4‑DIG ;其序列分别为SEQ ID NO.29~30和SEQ ID NO.31~33所示;
G1362A C1554A
(j)中最优的目标基因Pid4‑NPB特异性分子标记为Pid4‑NPB 及Pid4‑NPB ;其序列分别为SEQ ID NO.34~35和SEQ ID NO.36~38所示;
T1841A
(k)中最优的目标基因Pid4‑SN特异性分子标记组合为Pid4‑SN 及Pid4‑SN/C2250G
CO ;其序列分别为SEQ ID NO.39~40和SEQ ID NO.41~43所示;
其中,标记说明:F/N,功能性(functional)/非功能性(non‑functional);C1022T,意为#1022位点之SNP;基因符号为斜体,表示目标基因;基因符号为正体,表示目标基因之特异性标记,其中大写字符为目标基因供体品种之缩写,如DIG,意为Digu;特异性标记的PCR引物序列一般为正反各1条序列,少数位于基因组分化区域的标记其PCR引物序列则为3条序列。
3.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于在上述3个复杂的稻瘟病Pid抗病基因家族中对功能基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘,包括但不限于如下5个目标基因:
稻瘟病Pid‑2抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2‑ZS(曾用名:Pid2‑TTP),序列如GenBank MZ570869所示;
稻瘟病Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑TTP,序列如GenBank MZ570870所示;
稻瘟病Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑ZS(曾用名:Pid3‑MH),序列如GenBank MZ570872所示;
稻瘟病Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑NPB,序列如GenBank MZ983617所示;
稻瘟病Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑SN,序列如GenBank MZ983618所示。
4.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于在测序不完整的参考品种中鉴定该基因家族的已知功能基因,以及挖掘包括但不限于1个新型的目标基因:稻瘟病Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pid4‑CO;
抗病等位基因Pid4‑CO的序列如GenBank MZ570873所示。
5.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于在目标基因未知的种质资源中鉴定该基因家族的已知目标基因,以及挖掘包括但不限于6个稻瘟病Pid抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因;
抗病等位基因Pid2‑CKN的序列如GenBankMZ983612所示;
抗病等位基因Pid2‑SBL的序列如GenBank MZ983613所示;
抗病等位基因Pid3‑CKN的序列如GenBank MZ983614所示;
抗病等位基因Pid4‑LHZ的序列如GenBank MZ983615所示;
抗病等位基因Pid4‑SYZ(WT)的序列如GenBank MZ983616所示;
抗病等位基因Pid4‑TFB(WT)的序列如GenBank MZ983619所示。
6.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于精准甄别在该基因家族中因测序错误而普遍存在的真假基因组分化区域及SNP以及真假目标基因。