1.一种鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的方法,所述稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因包括Pid‑2、Pid‑3和Pid‑4,其特征在于,该方法由3套自成方法的“功能性单倍型‑抗病等位基因”二级检测标记组成,并各自逐级推进;供试品种是否携带目标基因由各套方法检测的综合结果而独立决定;
具体地,所述鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的方法包含:(1)一套鉴别并挖掘稻瘟病Pid‑2抗病基因家族等位基因的方法,包含:(a) Pid‑2基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;在后续的检测中,非功能性品种被排除;
(b) 该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2‑DIG的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计1个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid2‑DIG基因携带者属于Pid‑2抗病基因家族之功能性单倍型,而且该功能特异性分子标记之基因型与Pid2‑DIG参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid2‑DIG;
(c) 该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2‑ZS的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计1个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid2‑ZS基因携带者属于Pid‑2抗病基因家族之功能性单倍型,而且该功能特异性分子标记之基因型与Pid2‑ZS参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid2‑ZS;
(2)一套鉴别并挖掘稻瘟病Pid‑3抗病基因家族等位基因的方法,包含:(d) Pid‑3基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;在后续的检测中,非功能性品种被排除;
(e)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑DIG的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid3‑DIG基因携带者属于Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3‑DIG参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid3‑DIG;
(f)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑TTP的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid3‑TTP基因携带者属于Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3‑TTP参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid3‑TTP;
(g)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3‑ZS的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid3‑ZS基因携带者属于Pid‑3抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3‑ZS参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid3‑ZS;
(3)一套鉴别并挖掘稻瘟病Pid‑4抗病基因家族等位基因的方法,包含:(h) Pid‑4基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;在后续的检测中,非功能性品种被排除;
(i)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑DIG的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid4‑DIG基因携带者属于Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4‑DIG参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid4‑DIG;
(j)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑NPB的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid4‑NPB基因携带者应该属于Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4‑NPB参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid4‑NPB;
(k)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4‑SN的检测程序:通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP,并设计2个最优的特异性分子标记组合;进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pid4‑SN基因携带者属于Pid‑4抗病基因家族之功能性单倍型,而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4‑SN参考品种的基因型相同的品种;否则检测结果都不是目标基因Pid4‑SN;
具体地,上述方法中,
C1022T A1383G
(a)中所述2个单倍型特异性分子标记组合为Pid2‑F/N 及Pid2‑F/N ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.1 2和SEQ ID NO.3 4所示;
~ ~
C1022T A1383G
其中,所述Pid2‑F/N 和Pid2‑F/N 中的F/N指功能性_functional/非功能性_C1022Tnon‑functional;所述Pid2‑F/N 中的C1022T指位于Pid‑2基因序列ATG起始密码子起第
1022位点的SNP,C为功能型,T为非功能型;
A1383G
所述Pid2‑F/N 中A1383G指位于Pid‑2基因序列ATG起始密码子起第1383位点的SNP,A为功能型,G为非功能型;
T2058C
(b)中所述特异性分子标记为Pid2‑DIG ,其扩增引物为SEQ ID NO.5 6所示;
~
T2058C
所述Pid2‑DIG 中的T2058C指位于Pid‑2基因序列ATG起始密码子起第2058位点的SNP,T为目标基因,C为非目标基因;
A555G
(c)中所述特异性分子标记为Pid2‑ZS ,其扩增引物为SEQ ID NO.7 8所示;
~
A555G
其中,所述Pid2‑ZS 中的A555G指位于Pid‑2基因序列ATG起始密码子起第555位点的SNP,A为目标基因,G为非目标基因;
其中(a)‑(c)中所述pid‑2基因序列的GenBank基因登录号为FJ915121.1;
G2009A C2209T
(d) 中所述2个单倍型特异性分子标记组合为Pid3‑F/N 及Pid3‑F/N ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.9 10和SEQ ID NO.11 12所示;
~ ~
G2009A C2209T
其中,所述Pid3‑F/N 及Pid3‑F/N 中的F/N指功能性_functional/非功能性_G2009Anon‑functional;所述Pid3‑F/N 中的G2009A指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第
2009位点的SNP,G为功能型,A为非功能型;
C2209T
所述Pid3‑F/N 中的C2209T指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第2209位点的SNP,C为功能型,T为非功能型;
G775A G2695A
(e)中所述特异性分子标记组合为Pid3‑DIG 及Pid3‑DIG ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.13 14和SEQ ID NO.15 16所示;
~ ~
G775A
其中,所述Pid3‑DIG 中的G775A指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第775位点的SNP,G为目标基因,A为非目标基因;
G2695A
所述Pid3‑DIG 中的G2695A指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第2695位点的SNP,G为目标基因,A为非目标基因;
C1136T C1623G
(f)中所述特异性分子标记组合为Pid3‑TTP 及Pid3‑TTP ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.17 18和SEQ ID NO.19 20所示;
~ ~
C1136T
其中,所述Pid3‑TTP 中的C1136T指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第1136位点的SNP,C为目标基因,T为非目标基因;
C1623G
所述Pid3‑TTP 中的C1623G指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第1623位点的SNP,C为目标基因,G为非目标基因;
G477A C525T
(g)中所述特异性分子标记组合为Pid3‑ZS 及Pid3‑ZS ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.21 22和SEQ ID NO.23 24所示;
~ ~
G477A
其中,所述Pid3‑ZS 中的G477A指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第477位点的SNP,G为目标基因,A为非目标基因;
C525T
所述Pid3‑ZS 中的C525T指位于Pid‑3基因序列ATG起始密码子起第525位点的SNP,C为目标基因,T为非目标基因;
其中(d)‑(g)中所述pid‑3基因序列的GenBank基因登录号为FJ745364.1;
C1217G A1452G
(h) 中所述2个单倍型特异性分子标记组合为Pid4‑F/N 及Pid4‑F/N ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.25 26和SEQ ID NO.27 28所示;
~ ~
C1217G A1452G
其中,所述Pid4‑F/N 及Pid4‑F/N 中的F/N指功能性_functional/非功能性_non‑functional;
C1217G
所述Pid4‑F/N 中的C1217G指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第1217位点的SNP,C为功能型,G为非功能型;
A1452G
所述Pid4‑F/N 中的A1452G指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第1452位点的SNP,A为功能型,G为非功能型;
A1149T A1898G
(i)中所述特异性分子标记组合为Pid4‑DIG 及Pid4‑DIG ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.29 30和SEQ ID NO.31 33所示;
~ ~
A1149T
其中,所述Pid4‑DIG 中的A1149T指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第1149位点的SNP,A为目标基因,T为非目标基因;
A1898G
所述Pid4‑DIG 中的A1898G指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第1898位点的SNP,A为目标基因,G为非目标基因;
G1362A C1554A
(j)中所述特异性分子标记组合为Pid4‑NPB 及Pid4‑NPB ,其扩增引物分别为SEQ ID NO.34 35和SEQ ID NO.36 38所示;
~ ~
G1362A
其中,所述Pid4‑NPB 中的G1362A指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第1362位点的SNP,G为目标基因,A为非目标基因;
C1554A
所述Pid4‑NPB 中的C1554A指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第1554位点的SNP,C为目标基因,A为非目标基因;
T1841A C2250G
(k)中所述特异性分子标记组合为Pid4‑SN 及Pid4‑SN/CO ,其序列分别为SEQ ID NO.39 40和SEQ ID NO.41 43所示;
~ ~
T1841A
其中,所述Pid4‑SN 中的T1841A指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第1841位点的SNP,T为目标基因,A为非目标基因;
C2250G
Pid4‑SN/CO 中的C2250G指位于Pid‑4基因序列ATG起始密码子起第2250位点的SNP,C为目标基因,G为非目标基因;
其中(h)‑(k)中所述pid‑4基因序列的GenBank基因登录号为MG839283.1。