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专利号: 2021109680316
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株,其特征在于,是以敲除β‑半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM的植物乳杆菌为基础,插入纤维二糖2‑差向异构酶的编码基因。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌工程菌株,其特征在于,所述敲除β‑半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM的植物乳杆菌为植物乳杆菌NZ0203,按照专利文献201911223427.7记载的方法制备得到;

进一步优选的,所述植物乳杆菌NZ0203不能利用乳糖和乳果糖。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌工程菌株,其特征在于,所述纤维二糖2‑差向异构酶来源于解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus),其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,插入的纤维二糖2‑差向异构酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1所述的转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)构建敲除β‑半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM的植物乳杆菌NZ0203;

(2)将带有启动子Plac的纤维二糖2‑差向异构酶的编码基因连接到表达载体pNZ8148上,将表达载体pNZ8148中的诱导型启动子Pnis替换为乳糖诱导型强启动子Plac,得到重组质粒;

(3)将步骤(2)的重组质粒转化到步骤(1)的植物乳杆菌NZ0203中,筛选后即得转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株。

5.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中所述植物乳杆菌NZ0203按照专利文献201911223427.7记载的方法制备得到;

优选的,步骤(2)所述纤维二糖2‑差向异构酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中所述带有启动子Plac的纤维二糖2‑差向异构酶的编码基因获得方法如下:首先使用引物Plac‑F和Plac‑R,以植物乳杆菌WCFS1基因组DNA为模板,PCR扩增启动子Plac编码基因,启动子Plac编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;同时使用引物CE‑F和CE‑R,以人工合成的纤维二糖2‑差向异构酶的编码基因为模板,PCR扩增纤维二糖2‑差向异构酶编码基因;然后使用重叠拼接PCR方法将以上PCR扩增产物拼接,获得带有启动子Plac的纤维二糖2‑差向异构酶的编码基因;

其中,PCR扩增使用的引物序列如下:Plac‑F:5’‑GCGAGATCTGAAAAATCCCTCCGTAAATAG‑3’,Plac‑R:5’‑GAGGAAGCTCCTTTCAAAG‑3’,CE‑F:5’‑CTTTGAAAGGAGCTTCCTCATGGATATCACTCGTTTC‑3’,CE‑R:5’‑CGCGAGCTCTTAATCAACACGCTTGATG‑3’;

进一步优选的,所述启动子Plac编码基因的PCR扩增体系为:Ex taq buffer 25μL,dNTP 4μL,引物Plac‑F 2μL,引物Plac‑R 2μL,植物乳杆菌WCFS1基因组DNA 1μL,Ex taq 1μL,双蒸水13μL;

扩增程序为:

95℃预变性3min;95℃解链30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,重复30个循环;72℃维持

10min;4℃保存;

进一步优选的,所述纤维二糖2‑差向异构酶编码基因的PCR扩增体系为:Ex taq buffer 25μL,dNTP 4μL,引物CE‑F 2μL,引物CE‑R 2μL,人工合成的纤维二糖

2‑差向异构酶的编码基因1μL,Ex taq 1μL,双蒸水13μL;

扩增程序为:

95℃预变性3min;95℃解链30s,50℃退火30s,72℃延伸2min,重复30个循环;72℃维持

10min;4℃保存;

进一步优选的,所述重叠拼接PCR的扩增体系为:Ex taq buffer 25μL,dNTP 4μL,引物Plac‑F 2μL,引物CE‑R 2μL,启动子Plac编码基因1μL,纤维二糖2‑差向异构酶编码基因1μL,Ex taq 1μL,双蒸水12μL;

扩增程序为:

95℃预变性3min;95℃解链30s,50℃退火30s,72℃延伸2min30s,重复30个循环;72℃维持10min;4℃保存。

7.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中所述连接是将带有启动子Plac的纤维二糖2‑差向异构酶的编码基因和表达载体pNZ8148分别采用BglII和SacI限制性内切酶酶切,将酶切后的目的片段采用T4DNA连接酶进行连接。

8.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中所述转化的方法为电转化法。

9.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中所述筛选的方法为:将转化后得到的转化子在添加10μg/mL氯霉素的MRS固体培养基上培养,能够正常生长的即为阳性转化子;

进一步优选的,所述MRS固体培养基,每升组分如下:蛋白胨10.0g,牛肉浸粉5.0g,酵母浸粉4.0g,葡萄糖20.0g,磷酸氢二钾2.0g,柠檬酸三铵2.0g,醋酸钠5.0g,硫酸镁0.2g,硫酸锰0.05g,吐温80 1.0mL,琼脂粉20.0g,余量水。

10.权利要求1所述的植物乳杆菌工程菌株在以乳糖或乳清为底物生产乳果糖中的应用。