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专利号: 2014101203234
申请人: 中国科学院天津工业生物技术研究所
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法,其特征在于:包括如下步骤:

a、标准曲线的制备:设计针对梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的标准细菌的特异性引物,然后进行荧光定量PCR,根据拷贝数与CT值构建的标准曲线;

b、提取基因组DNA:利用洗脱、酶消化结合的方法提取酒醅微生物群落的宏基因组;所述利用洗脱、酶消化结合的方法提取酒醅微生物群落的总DNA的具体步骤如下:称取1g酒醅样品于50mL离心管,向离心管加入5mL PBS缓冲液pH7.64和8~9颗灭菌玻璃珠,漩涡震荡5min,200×g离心5min,在冰上吸取上清液;在沉淀中加入5mL PBS缓冲液重复洗涤两次,合并三次上清液,12000rpm离心5min,取沉淀;加入1mL CTAB抽提液和20μL巯基乙醇至离心管中,65℃恒温混匀仪振荡30min,加入5μL 20mg/mL蛋白酶k,37℃220r/min30min,室温6000×g离心10min,收集1mL上清;加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇,抽提一次,12000rpm离心10min,取上清加入等体积氯仿-异戊醇12000rpm离心10min,取上清,重复两次;上清液加入0.6倍体积预冷的异丙醇,-20℃沉淀1h,12000rpm离心

10min,倒掉液体;沉淀用70%乙醇洗涤,12000r/min离心10min;洗涤后的DNA吹干后TE溶解,-20℃冰箱保存备用;其中所述的CTAB抽提液配方为2%CTAB、5mol/L NaCl、1mol/L pH8.0的Tris-HCl、0.5mol/L EDTA;Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇的体积比25︰24︰1;

氯仿-异戊醇的体积比24︰1;

c、扩增:采用梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性引物,对酒醅微生物宏基因组中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性片段进行扩增;

d、定量分析:通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌进行定量分析;

步骤a和c中所述扩增乳酸菌的特异性引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示;

步骤a和c中所述扩增梭菌的特异性引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示;

步骤a和c中所述扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2.如权利要求1所述的酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法,其特征在于:步骤a中的操作如下:从酒醅微生物群落中提取分离纯化得到的1株梭菌(Clostridium butyricum)、1株乳酸菌(Lactobacillus crustorum)、1株芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的基因组,然后分别利用特异性引物进行PCR得到特异性目的片段,再将目的片段与TA克隆载体连接,获得重组质粒,再将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞,挑选阳性克隆转化子,提取得到高浓度质粒,将此高浓度质粒做10倍比稀释,作为荧光定量PCR的标准样品,从而进行荧光定量PCR获得标准曲线。

3.如权利要求1或2所述的酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法,其特征在于:步骤a和c中扩增梭菌特异性片段的PCR反应程序为:95℃预变性4min后,进入30个循环,95℃1min;57℃1min;72℃1min,最后72℃延伸10min;扩增乳酸菌、芽孢杆菌特异性片段的PCR反应程序为:95℃预变性4min后,进入30个循环,95℃1min;

55℃1min;72℃1min,最后72℃延伸10min。