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专利号: 2021108158691
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pi2/Pi9广谱持久抗病基因簇功能基因的技术体系,其特征在于,该技术体系由“单倍型‑亚单倍型‑功能基因”等三级检测标记组成并逐级推进;供试品种是否携带目标基因由其统合结果而决定;

具体地,所述技术体系包含:

(1)该基因簇之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序:通过簇内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域;设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性;只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种;

在后续的检测中,非功能性品种被排除;

(2)该基因簇之功能性单倍型之亚单倍型(Pi2/zt,Pi50/gm,Pi9,Piz)的检测程序为,通过簇内功能基因的序列比较而界定亚单倍型特异性的单核苷酸多态性位点(SNP);设计3个亚单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能性单倍型品种的亚单倍型分析而确认其可靠性;

(3)该基因簇之功能性单倍型之Pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性基因Pi2的检测程序为,通过簇内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP;分别设计其2个特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pi2基因携带者应该属于Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型,Pi2/zt亚单倍型,而且2个功能特异性分子标记皆为与Pi2参考品种相同基因型的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pi2;

(4)该基因簇之功能性单倍型之Pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性基因Piz‑t的检测程序为,通过簇内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP;分别设计其2个特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Piz‑t基因携带者应该属于Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型,Pi2/zt亚单倍型,而且2个功能特异性分子标记皆为与Piz‑t参考品种相同基因型的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Piz‑t;

(5)该基因簇之功能性单倍型之Pi50/gm亚单倍型之广谱持久抗性基因Pi50/Pigm的检测程序为,通过簇内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP;分别设计其2个特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pi50/Pigm基因携带者应该属于Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型,Pi50/gm亚单倍型,而且2个功能特异性分子标记皆为与Pi50/Pigm参考品种相同基因型的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pi50/Pigm;

特别地,Pi50与Pigm是“异名同质基因”。

(6)该基因簇之功能性单倍型之Pi9亚单倍型之广谱持久抗性基因Pi9的检测程序为,通过簇内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP;分别设计其2个特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Pi9基因携带者应该属于Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型,Pi9亚单倍型,而且2个功能特异性分子标记皆为与Pi9参考品种相同基因型的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pi9;

(7)该基因簇之功能性单倍型之Piz亚单倍型之广谱持久抗性基因Piz的检测程序为,通过簇内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP;分别设计其2个特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性;Piz基因携带者应该属于Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型,Piz亚单倍型,而且2个功能特异性分子标记皆为与Piz参考品种相同基因型的品种(个体);反之,任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Piz。

2.根据权利要求1所述技术体系,其特征在于:P/A(933~1239)

(1)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为Pi2/9‑F/N /Pi2/9‑F/P/A(3808~4033)

N ;其序列分别为SEQ ID NO.1~2和SEQ ID NO.3~4所示;

其中,标记说明:F/N,功能性(functional)/非功能性(non‑functional);P/A,存在(presence;目标基因型)/缺失(absence;非目标基因型);933~1239,意为#933~1239基因组区段,如此类推;

A2726G/T

(2)中最优的亚单倍型特异性分子标记组合为Pi2/zt/z‑SubH //Pi2/zt/50/gm‑C6739A C7793T

SubH //Pi9/z‑SubH ;其序列分别为SEQ ID NO.5~6,SEQ ID NO.7~8和SEQ ID NO.9~10所示;

CAG7902TGT/CGT T7992G(3)中最优的目标基因特异性分子标记组合为Pi2 及Pi2 ;其序列分别为SEQ ID NO.11~12和SEQ ID NO.13~16所示;

T7992G

特别地,Pi2 的最优PCR检测体系为3条正向引物与1条反向引物搭配;

GAC7905TTC/TTA TG8028CT(4)中最优的目标基因特异性分子标记组合为Pi2/zt 及Pizt/50/gm ;

其序列分别为SEQ ID NO.17~18和SEQ ID NO.19~20所示;

A7746G G8626C

(5)中最优的目标基因特异性分子标记组合为Pi50/gm 及Pi50/gm ;其序列分别为SEQ ID NO.21~22和SEQ ID NO.23~24所示;

T7257C T6709G

(6)中最优的目标基因特异性分子标记组合为Pi9 及Pi9/z ;其序列分别为SEQ ID NO.25~26和SEQ ID NO.27~28所示;

T6709G A7099G

(7)中最优的目标基因特异性分子标记组合为Pi9/z 及Piz ;其序列分别为SEQ ID NO.27~28和SEQ ID NO.29~30所示。

3.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于在复杂的稻瘟病Pi2/Pi9抗病基因簇中对功能基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘,包括但不限于如下8个目标基因:

稻瘟病Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型之Pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性基因Pi2;

稻瘟病Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型之Pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性基因Piz‑t;

稻瘟病Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型之Pi50/gm亚单倍型之广谱持久抗性基因Pi50/Pigm;

稻瘟病Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型之Pi9亚单倍型之广谱持久抗性基因Pi9;

稻瘟病Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型之Piz亚单倍型之未克隆的广谱持久抗性基因Piz;

抗病基因Piz的序列如GenBank MZ570866所示。

4.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于在未知的种质资源中鉴定该基因簇的已知功能基因,以及挖掘包括但不限于2个新型的目标基因:稻瘟病Pi2/Pi9抗病基因簇之功能性单倍型之Piz亚单倍型之新型抗病基因Piz‑MWZ及Piz‑TFB;

抗病基因Piz‑MWZ的序列如GenBank MZ570867所示;

抗病基因Piz‑TFB的序列如GenBank MZ570868所示。

5.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于精准甄别在该基因簇中因测序错误而普遍存在的真假特异性基因组区域及SNP。

6.权利要求1或2所述技术体系的应用,其特征在于,应用于精准甄别在该基因簇中可能存在的、包括但不限于“等位基因”、“异名同质基因”、“同名异质基因”及“真假目标基因”。

7.权利要求1或2所述技术体系在开发其他植物病害系统抗病基因的挖掘及鉴定方法方面的应用。

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