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专利号: 2021107412214
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-03-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器,其特征在于:所述荧光化学传感器包括末端脱氧核苷酸转移酶、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶Fpg和多核苷酸激酶,Fpg识别并切除DNA的两个8‑oxoG碱基,产生单链DNA片段和双链DNA片段;DNA损伤位点包括孤立性DNA损伤位点和聚集性DNA损伤位点;还包括外切酶Exo I、外切酶Exo III、poly A链、链霉亲和素包裹的磁珠、生物素标记的核苷酸、dTTP和Cy5‑dUTP;生物素标记的核苷酸包括biotin‑ddATP和biotin‑dCTP。

2.利用权利要求1所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器进行非疾病诊断目的的检测DNA损伤位点的方法,其特征在于:所述方法为:生物素化的DNA与链霉亲和素包裹的磁珠混合发生捕获,得到磁珠DNA;生物素化的DNA的制备方法:通过末端脱氧核苷酸转移酶介导使生物素标记的核苷酸biotin‑ddATP掺入DNA;磁珠DNA被甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶处理,磁珠DNA被切除两个8‑oxoG碱基,得到两个DNA片段;两个DNA片段分别为单链DNA片段1和双链DNA片段2;然后多核苷酸激酶催化两个DNA片段的3’磷酸端去磷酸化,生成3’OH端,两个DNA片段的3’OH在TDT扩增酶的作用下与生物素标记的核苷酸biotin‑dCTP结合;分离两个DNA片段在TDT扩增酶的作用下将dTTP和Cy5‑dUTP结合到两个DNA片段的3’OH端,得到带有Cy5标记的富含U和T的长链;poly A链与富含U和T的长链进行杂交,poly A的3’‑ OH末端启动TDT介导的延伸反应,形成新的富含U和T的Cy5标记链;新的poly A链与新形成的U和T富链杂交,引发新的TDT介导的延伸反应周期,诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物;分离出游离Cy5‑dUTP后,经过外切酶Exo I和外切酶Exo III的切割,得到丰富的Cy5‑dUTP单核苷酸。

3.如权利要求2所述的检测DNA损伤位点的方法,其特征在于:单链DNA片段1的3’OH端用生物素标记的核苷酸biotin‑dCTP整合。

4.如权利要求2所述的检测DNA损伤位点的方法,其特征在于:poly A链的浓度≤0.5微摩尔每升。