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专利号: 2021107412214
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-03-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器,其特征在于:所述荧光化学传感器包括末端脱氧核苷酸转移酶、甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶、多核苷酸激酶,Fpg识别并切除DNA的两个8‑oxoG碱基,产生单链DNA片段和双链DNA片段。

2.如权利要求1所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器,其特征在于:还包括poly A链。

3.如权利要求1所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器,其特征在于:还包括链霉亲和素包裹的磁珠和生物素标记的核苷酸。

4.如权利要求3所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器,其特征在于:生物素标记的核苷酸包括biotin‑ddATP、biotin‑dCTP、biotin‑dTTP。

5.如权利要求1所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器,其特征在于:DNA损伤位点包括孤立性DNA损伤位点和聚集性DNA损伤位点;

或,还包括外切酶;进一步外切酶包括外切酶I(Exo I)和外切酶III(Exo III)。

6.利用权利要求1‑5任一所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器进行检测DNA损伤位点的方法,其特征在于:所述方法为:生物素化的DNA与链霉亲和素包裹的磁珠混合发生捕获,得到磁珠DNA;

磁珠DNA被甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶处理,磁珠DNA被切除两个8‑oxoG碱基,得到两个DNA片段;

然后加入多核苷酸激酶,催化两个DNA片段的3’磷酸端去磷酸化,生成3’OH端,两个DNA片段的3’OH在TDT扩增酶的作用下与Cy5‑dUTP、生物素标记的核苷酸结合,得到带有Cy5标记的富含U和T的长链。

7.如权利要求6所述的检测DNA损伤位点的方法,其特征在于:生物素化的DNA的制备方法:通过末端脱氧核苷酸转移酶介导使生物素标记的核苷酸掺入DNA;

或,两个DNA片段分别为单链DNA片段1和双链DNA片段2。

8.如权利要求6所述的检测DNA损伤位点的方法,其特征在于:单链DNA片段1的3’OH端用生物素标记的核苷酸整合。

9.如权利要求6所述的检测DNA损伤位点的方法,其特征在于:带有Cy5标记的富含U和T的长链与poly A链杂交得到带有Cy5标记的DNA产物,分离出Cy5‑dUTP后经过外切酶切割后得到Cy5‑dUTP单核苷酸;

优选的,poly A链的浓度≤0.5微摩尔每升;

优选的,poly A链与富含U和T的长链进行杂交,poly A的3’‑OH末端启动TDT介导的延伸反应,形成新的富含U和T的Cy5标记链;

优选的,新的poly A链与新形成的U和T富链杂交,引发新的TDT介导的延伸反应周期,诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物。诱导超支化扩增产生大量带有Cy5标记的DNA产物,大大提高了检测灵敏度;

优选的,分离出游离Cy5‑dUTP后,经过外切酶I(Exo I)和外切酶III(Exo III)的切割,得到丰富的Cy5‑dUTP单核苷酸。

10.权利要求1‑5任一所述的单分子检测DNA损伤位点的荧光化学传感器在DNA氧化损伤检测中的应用。