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专利号: 2021107094870
申请人: 徐州工程学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-03-25
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于迟缓爱德华氏菌检测的基因芯片探针组,其特征在于,包括捕获探针ET‑CP、检测探针ET‑DP、滚环探针ET‑RCP,其中所述检测探针ET‑DP是由ET‑DPA,ET‑DPB和ET‑DPC按照5’‑3’方向依次连接而成;

所述捕获探针ET‑CP和所述检测探针ET‑DP序列包括如下任意一组所示的序列:(1)ET‑CP1:5’‑NH2‑TTTTTTTGCGTCGATCTGATTAGCCA‑3’;

ET‑DP1:5’‑CCTGCTGGGAGTTTCTGGATGTCAGAACACACGGGATACAGGA‑3’,其中,ET‑DP1A:CCTGCTGGGAGTTTCTG与迟缓爱德华氏菌基因组DNA互补;ET‑DP1B:GATGTC;ET‑DP1C:AGAACACACGGGATACAGGA,且与所述滚环探针ET‑RCP的5’端和3’端序列互补,同时是所述滚环探针ET‑RCP的引物和连接区域;

(2)ET‑CP2:5’‑NH2‑TTTTTTTCCTTAATCACGTCGAG‑3’;

ET‑DP2:5’‑CTCCCCTTTATCCAGC‑ACTTAC‑AGAACACACGGGATACAGGA‑3’,其中,ET‑DP2A:CTCCCCTTTATCCAGC与迟缓爱德华氏菌基因组DNA互补;ET‑DP2B:ACTTAC;ET‑DP2C:AGAACACACGGGATACAGGA,且与所述滚环探针ET‑RCP的5’端和3’端序列互补,同时是所述滚环探针ET‑RCP的引物和连接区域;

(3)ET‑CP3:5’‑NH2‑TTTTTTTCATGGTCTTCTGGATCTGCA‑3’;

ET‑DP3:5’‑GCTGCGCCTGGGTGACGA‑GATGTC‑AGAACACACGGGATACAGGA‑3’;其中,ET‑DP3A:GCTGCGCCTGGGTGACGA与迟缓爱德华氏菌基因组DNA互补;ET‑DP3B:GATGTC;ET‑DP3C:AGAACACACGGGATACAGGA,且与所述滚环探针ET‑RCP的5’端和3’端序列互补,同时是所述滚环探针ET‑RCP的引物和连接区域;

(4)ET‑CP4:5’‑NH2‑GCGTCGATCTGATTAGCCA‑3’;

ET‑DP4:5’‑CAGACGTTATAGGACTG‑ACTTAC‑AGAACACACGGGATACAGGA‑3’;其中,ET‑DP4A:CAGACGTTATAGGACTG与迟缓爱德华氏菌基因组DNA互补;ET‑DP4B:ACTTAC;ET‑DP4C:AGAACACACGGGATACAGGA,且与所述滚环探针ET‑RCP的5’端和3’端序列互补,同时是所述滚环探针ET‑RCP的引物和连接区域;

所述滚环探针ET‑RCP:5’‑CGTGTGTTCTATTCTACTGTATTCTGTATGTCTCCGTCTGCCTGTCACCTGTGTATCTTTGTCCCGTCAGTCCTGTATCC‑3’,其中所述滚环探针ET‑RCP 5’和3’序列与所述ET‑DP1C、ET‑DP2C、ET‑DP3C和ET‑DP4C序列互补;

所述ET‑CP1、ET‑CP2、ET‑CP3、ET‑CP4序列与迟缓爱德华氏菌基因组DNA互补;所述ET‑DP1A、ET‑DP2A、ET‑DP3A、ET‑DP4A序列与迟缓爱德华氏菌基因组DNA互补;ET‑CP系列探针中的ET‑CP1、ET‑CP2、ET‑CP3、ET‑CP4序列,与ET‑DP系列探针中的ET‑DP1A、ET‑DP2A、ET‑DP3A、ET‑DP4A序列在迟缓爱德华氏菌基因组DNA存在时,相应的在T4 DNA连接酶作用下连接。

2.根据权利要求1所述的基因芯片探针组,其特征在于,所述基因芯片探针组还包括阴性对照探针ET‑NC和阳性对照探针ET‑PC,ET‑NC和ET‑PC序列不含有与迟缓爱德华氏菌基因组DNA序列互补的序列。

3.根据权利要求1所述的基因芯片探针组检测迟缓爱德华氏菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤(1),探针设计:根据待检测样品中检测的迟缓爱德华氏菌的基因序列与NCBI数据库中迟缓爱德华氏菌的基因组DNA进行比对,选择高度保守性序列作为探针,所述探针分别具有所述捕获探针ET‑CP、检测探针ET‑DP、滚环探针ET‑RCP的碱基序列;

步骤(2),探针合成:人工合成所述捕获探针ET‑CP、检测探针ET‑DP、滚环探针ET‑RCP的碱基序列,制备目的探针;

步骤(3),芯片点制:把所合成的5’‑氨基修饰的所述捕获探针ET‑CP与芯片点样液混合,进行点阵排布,点制在醛基基片上,制备成微阵列;

步骤(4),芯片杂交:把所述检测探针ET‑DP、滚环探针ET‑RCP与迟缓爱德华氏菌基因组DNA混合,经过变性处理,加到所述微阵列上,进行退火反应和连接反应;

步骤(5),滚环扩增:将退火的微阵列进行洗脱,加入含有biotin‑dUTP的滚环扩增反应溶液,进行滚环扩增,加入链亲和素与滚环扩增产物结合;

步骤(6),结果扫描:采用荧光仪扫描芯片,若产生荧光信号即为阳性结果,所述待测样品中有迟缓爱德华氏菌;若无荧光信号即说明结果为阴性,待测样品中没有迟缓爱德华氏菌。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述退火反应为95℃变性

5min,50℃杂交反应4h。

5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,连接反应系包括:T4 DNA连接酶1μL、10×T4缓冲液2.5μL、无菌ddH2O 21.5μL;

连接条件为:35‑40℃连接反应20‑40min。

6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(5)中滚环扩增反应体系包括:DNA聚合酶1μL、10×DNA聚合酶缓冲液2.5μL、dNTP mixture 2μL、biot in‑dUTP 0.2μL、100×BSA 

0.5μL、无菌ddH2O 18.8μL;

滚环扩增条件为:25‑35℃密闭扩增1.5‑3.5h。

7.根据权利要求1‑2任一项所述的基因芯片探针组在制备检测迟缓爱德华氏菌产品中的应用。