1.一种酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽的制备方法,其特征在于,具体按下列步骤进行:
1)牛乳酪蛋白的提取
牛乳酪蛋白的提取是将鲜牛乳离心脱脂后,利用等电点沉淀法将牛乳沉淀后弃去上清液,所得沉淀洗涤后,即为粗酪蛋白;
2)酪蛋白酶解物的制备
牛乳酪蛋白酶解液的制备是将粗酪蛋白用胰蛋白酶在规定的底物浓度、pH、温度和加酶量条件下水解规定时间后,灭酶,冷却,离心,上清液真空浓缩后得酶解浓缩物;
所述的牛乳酪蛋白酶解物的制备方法是,称取适量的牛乳酪蛋白粗品,配置30g/kg~60g/kg的牛乳酪蛋白溶液,调节pH至7.5,95℃加热5min,冷却到50℃~70℃,加入300-500U/g的胰蛋白酶,用2mol/L的NaOH溶液使pH值保持恒定,酶解4.0h后,95℃灭酶10min,冷却到室温,10000g离心15min,取上清液在45~50℃,0.09MPa下浓缩,得牛乳酪蛋白酶解浓缩物;
所述的胰脂肪酶抑制肽的一级结构为:
SLKALEVPLAARLGVPFPKALVL,LLLAKVSLMLVTVLFPKALVL和TKVVLVQAPLKGFLLAKLVML,其分子量均在3000以下;
3)酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽脱盐及分离纯化
将步骤2)获得的乳酪蛋白酶解浓缩液,先通过大孔吸附树脂层析柱脱盐、再用超纯水洗脱,收集超纯水洗脱液,真空浓缩,再过凝胶色谱柱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化,冷冻干燥,即得酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽粉。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的牛乳酪蛋白的提取的方法是,取鲜牛乳过滤除杂,低温离心脱脂,调节脱脂牛乳的pH值到4.5,沉淀酪蛋白,4000r/min离心10min,弃去上清液,沉淀用50mM的pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2次,每次洗涤后4000r/min离心10min,所得沉淀物为酪蛋白粗品。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的酪蛋白源胰脂肪酶抑制肽脱盐及分离纯化方法是,对大孔吸附树脂LS-106进行预处理后,将获得的牛乳酪蛋白酶解浓缩物,先后通过大孔吸附树脂层析柱、凝胶色谱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化;
所述大孔吸附树脂用超纯水洗脱,流速为1.5~2BV/h,收集超纯水的洗脱液,真空浓缩,再过凝胶色谱柱纯化;所述凝胶色谱的色谱柱为Peptide10/300GL柱,流动相为超纯水,流速0.8mL/min,进样量500μL,收集左数第2个峰即峰2,浓缩后即为精制胰脂肪酶抑制肽,再用半制备型高效液相色谱仪进一步纯化,收集其中的三个主峰,分别称为F2-1、F2-2和F2-3,分别冷冻干燥即得纯胰脂肪酶抑制肽粉。