1.一种重组细胞色素P450酶,其特征在于:重组细胞色素P450酶所编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种由权利要求1所述重组细胞色素P450的编码基因构建的重组载体,其特征在于:为质粒pET28b(+)-细胞色素P450。
3.一种由权利要求2所述重组载体转化制备的重组基因工程菌,其特征在于:为重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28b(+)-细胞色素P450。
4.如权利要求3所述的重组基因工程菌的制备方法,其特征在于依次进行如下步骤:(1)将重组细胞色素P450的编码基因克隆至外源基因表达质粒上,获得重组质粒;
(2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞,接种至LB液体培养基,20~37℃、50~250r/min振荡培养0.5~2h,获得转化产物;
(3)将转化产物涂布于含50μg/mL卡那霉素的平板,20~37℃培养,筛选获得含重组细胞色素P450编码基因的工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌的制备方法,其特征在于:
所述外源基因表达质粒为下列之一:①pET系列,②pUC系列,③pGEM系列,④pBluescript系列。
6.如权利要求1所述重组细胞色素P450的用途,其特征在于:降解二氯甲烷。
7.如权利要求1所述重组细胞色素P450的用途,其特征在于:所述重组细胞色素P450在降解底物上具有广谱性。
8.根据权利要求6所述的重组细胞色素P450的用途,其特征在于:将含重组细胞色素P450编码基因的工程菌经发酵培养,得发酵液;
将发酵液中提取的重组细胞色素P450与PBS缓冲液混合,加入底物二氯甲烷、辅酶构成反应体系,在25~45℃反应完全,所述反应体系中,缓冲液pH为5~10;所述反应体系中,辅酶浓度为0.1~0.5g/L。
9.根据权利要求7所述的重组细胞色素P450的用途,其特征在于:将含重组细胞色素P450编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液提取的重组细胞色素P450与pH为8的PBS缓冲液混合,加入10mg/L的底物、辅酶构成反应体系,在35℃水浴中反应。
10.如权利要求6~9任一所述的应用,其特征在于所述重组细胞色素P450按如下方法制备:(1)将含重组细胞色素P450编码基因的工程菌接种至LB固体培养基,在20~37℃下活化后接入LB液体培养基,在20~37℃、50~250r/min培养8~48h后,以体积浓度0.1%~
20%接种量转入发酵培养基,20~37℃、50~250r/min培养至OD600达到0.4-1.0后,加入诱导剂IPTG,IPTG终浓度0.01~1.51mM,在20~37℃、50~250r/min培养4~48h后,获得发酵液;
(2)将发酵液离心取菌体,用PBS缓冲液(pH 7)洗涤之后,加入PBS缓冲液混匀,在工作3秒暂停2秒循环99次的条件下超声破碎后,离心收集上清;将细胞破碎液离心所得的上清液与binding buffer按1:1的体积比混合,加入镍柱中与填料混匀,并以每小时柱体积的10倍的流速流出;用15倍柱体积的binding buffer洗涤柱子,以洗去被污染的蛋白质;用5倍柱体积的elution buffer洗脱,收集洗脱峰,获得纯酶溶液。