欢迎来到知嘟嘟! 联系电话:13336804447 卖家免费入驻,海量在线求购! 卖家免费入驻,海量在线求购!
知嘟嘟
我要发布
联系电话:13336804447
知嘟嘟经纪人
收藏
专利号: 2020109987423
申请人: 四川中烟工业有限责任公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
价格&联系人
年费信息
委托购买

摘要:

权利要求书:

1.一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述方法包括:

收集、染色和分选发酵中的未经卷制的雪茄烟叶上的微生物,然后通过测定微生物产物中的醛/酮物质的浓度和鉴定醛/酮物质的种类来验证筛选效果,筛选的菌株经过培养后醛酮物质产量在50-300μg/mL,主要代谢产物为苯甲醛、异佛尔酮、2,4-二甲基苯甲醛、羟基丙酮、苯乙醛、香草醛和异戊醛,即表示该方法可以有效的用于产醛酮类风味物质菌株的分离和筛选。

2.如权利要求1所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述方法具体步骤如下:(1)称取烟叶并加入灭菌的生理盐水或中性的磷酸盐缓冲液,振荡分离烟叶和微生物,离心收集微生物;

(2)将收集的微生物复溶后加入荧光染料cy5-hydrazide,在暗处染色;

(3)差速离心分离微生物和未结合的染料,先通过荧光显微镜检测菌株的的染色情况,然后通过流式细胞仪将被荧光标记的菌株分选至装有YH培养基的96深孔板中进行培养;

(4)通过2,4-硝基苯肼测定培养基中醛酮化合物的含量,再使用GC-MS鉴定产物的种类;

(5)然后基于16s rRNA鉴定筛选微生物的种类。

3.如权利要求2所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述步骤(1)中烟叶上微生物的收集是称取1-5g烟叶,以1∶40-50(g/v)比例加入灭菌的生理盐水或中性的磷酸缓冲液,以200-250rmp转速振荡1-2h,然后分离烟叶碎片和微生,以

4000-5000rmp的转速收集微生物。

4.如权利要求2所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述步骤(2)中微生物的染色是先加入1-2mL的缓冲液重悬微生物,然后加入荧光染料cy5-hydrazide至体系中,染料浓度为1-2mg/mL,并在暗处染色1-2h。

5.如权利要求2所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述步骤(3)中通过流式细胞仪筛选荧光强度较高的菌株。

6.如权利要求2所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述步骤(3)YH培养基成分为:葡萄糖20g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨20g/L,大豆蛋白胨

10g/L,MgSO4 0.5g/L,KH2PO4 1g/L,CaCl2 0.2g/L。

7.如权利要求2所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述步骤(3)中的培养为条件,在35-45℃,600-800rpm培养36-48h。

8.如权利要求2所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述步骤(4)醛酮类化合物浓度测定方法是取50μL培养上清中加入50μL 2,4-硝基苯肼,静置反应30min,再加入500μL KOH(1mol/L)和400μL去离子水,在500nm处测定吸光度值。

9.如权利要求2所述的一种筛选产醛或酮类风味物质微生物的高通量方法,其特征在于,所述步骤(4)中醛酮化合物的鉴定方法是取500μL培养上清在液氮中冷冻后,在真空冷冻机中进行冷冻干燥,然后加入500μL无水乙醇进行复溶,再加入500μL丙酮去除蛋白,然后再使用GC-MS鉴定化合物。

10.如权利要求1-9任一所述方法在微生物筛选、醛酮类物质开发生产、天然风味物质生产中的应用。