1.水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于在水稻OsPDCD5基因CDS区域选取靶标片段,采用pBWA(V)H-cas9质粒为表达载体,将水稻OsPDCD5基因CDS区域选取的靶标片段的靶序列插入到pBWA(V)H-cas9质粒,然后将得到的pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒再转化到籼稻昌恢T025中,经PCR检测以及一代测序筛选得到的直链淀粉含量降低的籼稻昌恢T025-4和T025-7突变株。
2.如权利要求1所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于所述的水稻OsPDCD5基因CDS区域选取靶标片段的靶序列如SEQ.ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于所得的直链淀粉含量降低的籼稻昌恢T025-4突变株的靶序列如SEQ ID NO:14所示。
4.如权利要求1所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于所得的直链淀粉含量降低的籼稻昌恢T025-7突变株的靶序列如SEQ ID NO:15所示。
5.如权利要求1所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于所述的pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒转化到籼稻昌恢T025中,其具体步骤如下:将籼稻昌恢T025成熟种子去壳消毒后接种在诱导培养基上进行诱导愈伤,26-28℃暗培养约15-20天后继代一次得到籼稻昌恢T025愈伤组织,将经纯化的pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒采用农杆菌介导法导入籼稻昌恢T025愈伤组织细胞,即完成pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒到籼稻昌恢T025的转化。
6.如权利要求5所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于所述的pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒采用农杆菌介导法导入籼稻昌恢T025愈伤组织细胞,具体包括如下步骤:
(1)、pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒转化农杆菌EHA105, 具体包括如下步骤:①按体积百分10%的比例,将pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒加入到农杆菌EHA105感受态细胞中,依次冰上放置30min、浸入液氮中5min,37℃水浴5min,得到含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞;
②按体积百分比为22%的比例,将上述得到的含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞加入到不加抗生素的LB液体培养基控制温度为28℃、转速为150-
160rpm进行发酵3-4h,得到发酵液;
将上述所得的发酵液控制转速4000 rpm离心10min收集菌体,将离心收集到的菌体用为发酵液体积11%的离心后所得的上清混匀,然后涂在含有20ug/ml利福平、25ug/ml庆大霉素和30ug/ml卡那霉素的LB平板培养基上28℃培养36-72h,在LB平板培养基上形成菌斑;
PCR鉴定成功的菌斑即为含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105;
挑取PCR鉴定成功的菌斑1个进行1.5ml EP管接菌并置于28℃摇床中培养,这样就得到了含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105种子液;
上述1.5ml EP管中含有1ml的含有20ug/ml利福平、25ug/ml庆大霉素和30ug/ml卡那霉素的LB液体培养基;
(2)、T025成熟种子愈伤的诱导与培养籼稻昌恢T025成熟种子去壳消毒后接种在诱导培养基上进行诱导愈伤,26-28℃暗培养约15-20天后继代一次得到籼稻昌恢T025愈伤组织;
(3)、农杆菌侵染
①将含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105种子液按体积比为10-11%的接种量接种至含有50ug/ml利福平和50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中,控制温度为28℃培养直到含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105菌液的浓度OD600≈
0.8,收集菌液;
②悬浮
将上述所得的OD600≈0.8的含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105菌液于50 ml离心管离心富集1次,悬浮至50ml侵染液中,控制温度为28℃、转速为200rpm继续培养至OD600≈0.1;
感染
将步骤(2)培养的籼稻昌恢T025愈伤组织在无菌滤纸上晾一下,然后一次性转入到OD600≈0.1的含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105菌液并混合均匀,然后控制转速为150rpm混合15~20 min,然后倒出菌液,得到被感染的愈伤组织;
④共培养
将步骤③所得的被感染的愈伤组织在无菌滤纸上放置至菌液吸干,然后接至N6D-AS培养基中,控制温度为22℃暗培养2~3天,得到被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织;
(4)、抗性愈伤组织的筛选
①将步骤(3)所得的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织用无菌水清洗至流出液清亮透明,加入到含有特美汀500 mg/L的N6D液体培养基中,控制转速为100 rpm混合15-20 min,倒掉含有特美汀500 mg/L的N6D液体培养基,无菌水洗净,再加入含有特美汀500 mg/L的N6D液体培养基,100rpm,15-20min,倒掉含有特美汀500 mg/L的N6D液体培养基;
重复上述动作2-3次,得到弱抗特美汀的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织;
②将①中得到的弱抗特美汀的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织倒在无菌滤纸上吸干后转入含有特美汀250 mg/L的N6D液体培养基中,不加潮霉素B,控制温度为28℃条件下暗培养7~10d,得到具有强特美汀抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织粗品;
(5)、将步骤(4)得到的具有强特美汀抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈 伤组织粗品,置于含有特美汀500 mg/L和潮霉素B 50 mg/L的选择培养基平板上进行第一次筛选培养,筛选培养过程中控制温度为28℃进行培养15~20d;
重复上述的筛选过程一次,得到淡黄色的具有强特美汀和潮霉素B抗性的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织。
7.如权利要求6所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于步骤(1)中PCR鉴定所用的引物Pbw2+的序列如SEQ ID NO:6所示, 引物Pbw2-的序列如SEQ ID NO:7所示,PCR鉴定成功的阳性条带序列如SEQ ID NO:8所示。
8.如权利要求6所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用,其特征在于步骤(3)农杆菌侵染过程中悬浮所用的侵染液,按每升计算,由2.2 g MS粉、68.5g葡萄糖、174mg精氨酸、876mg谷氨酰胺、30g蔗糖、100μmol AS和余量的水组成。
9.如权利要求6所述的水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用中得到的一种含有pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5重组质粒的农杆菌EHA105。