1.一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)优化玉米醇溶蛋白降解酶基因;
(2)构建重组表达载体pPICZαA‑ZDP;
(3)将重组表达载体pPICZαA‑ZDP转化毕赤酵母,获得阳性克隆,进行培养;
(4)将培养的菌液离心,获得培养上清液;进行亲和层析纯化,获得纯化的玉米醇溶蛋白降解酶;
步骤(1)根据毕赤酵母的密码子偏好性和pPICZαA载体特点,对玉米醇溶蛋白降解酶基因进行优化,优化后的基因片段为SEQ ID NO.1;
步骤(2)构建重组表达载体pPICZαA‑ZDP的具体步骤如下:利用EcoR I和Xba I限制性内切酶分别对优化后的玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和表达质粒pPICZαA进行双酶切;胶回收优化后的玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和pPICZαA质粒片段;取优化后的玉米醇溶蛋白降解酶目的片段4 μl,T4连接酶和缓冲液共5 μl,纯化的pPICZαA载体1 μl混匀,16℃循环水浴孵育过夜;转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,于含Amp的LB培养基中筛选阳性克隆;挑取白色菌落加入到含Amp的液体LB培养基中,37℃震荡过夜培养,待培养基浑浊后,提取重组表达载体质粒pPICZαA‑ZDP,并进行酶切验证;所述T4连接酶为4 μl,缓冲液为1 μl;
步骤(3)转化毕赤酵母的具体步骤如下:利用限制性内切酶Sac I对重组表达载体pPICZαA‑ZDP进行酶切,对酶切产物进行纯化;纯化的表达载体pPICZαA‑ZDP转入毕赤酵母X33感受态细胞,于含博来霉素的YPD培养基中培养,通过PCR扩增反应筛选阳性克隆;挑取1个阳性克隆白色菌落加入到2mL YPD培养基中,30℃、160 rpm震荡过夜培养;将全部菌液转入到200mL BMGY培养基中,30℃震荡过夜培养,用于发酵罐培养。
2.权利要求1所述的玉米醇溶蛋白降解酶在水解玉米醇溶蛋白中的应用。
3.权利要求1所述的玉米醇溶蛋白降解酶在促进淀粉酶降解玉米淀粉中的应用。