1.一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、对待测活性污泥进行离心分离,收集固体样品;采用缓冲液对固相产物进行反复冲洗;采用缓冲溶液对冲洗后的固相样品定容,至待测活性污泥的原始容积,并混合均匀,得到活性污泥样品;
步骤2、对活性污泥样品进行破碎,离心,得到上清液;在上清液中加入苯乙醇和十二烷基-beta-D-麦芽糖苷进行反应,反应结束后,离心,得到待测一氧化氮还原酶样品;
步骤3、在厌氧状态下,向密闭容器中加入缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯溶液,并充入一氧化氮气体,得到酶活性反应液;在酶活性反应液中加入步骤2中的待测一氧化氮还原酶样品,震荡后,利用气相色谱法,测定氧化亚氮的含量,进而计算得到一氧化氮还原酶的活性。
2.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,步骤1中,冲洗过程中的缓冲液采用20-200mM的Tris-HCL缓冲液,pH为7.5-8.0;
步骤1及步骤3中,缓冲溶液采用在5-50mM的Tris-HCL缓冲液中加入KCl配制得到,其中,KCl的浓度为15-150mM。
3.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,步骤1中,离心过程,离心转速为4000-5000r/min,离心时间为5-15min。
4.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,步骤2中,破碎后的离心过程,采用在5000-6000g条件下,离心时间为10-15min;反应后的离心过程,采用在40000-186400g条件下,离心时间为90-120min。
5.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,步骤1及步骤2的温度条件为4℃以下。
6.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,步骤2中,将活性污泥样品置于低温高压细胞破碎仪中进行破碎,破碎功率为500-
1000bar。
7.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,步骤2中,苯乙醇及十二烷基-beta-D-麦芽糖苷的体积比为(0.1-0.5):(0.1-0.5);
其中,苯乙醇溶液的质量浓度为0.02%、十二烷基-beta-D-麦芽糖苷的质量浓度为1%。
8.根据权利要求2所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,酶活性反应液中缓冲溶液、抗坏血酸钠溶液、乙酸钠溶液及吩嗪硫酸甲酯的体积比为2.6:0.1:0.1:0.1;其中,抗坏血酸钠溶液的浓度为1-1.5M,乙酸钠溶液的浓度为2.5-3M,吩嗪硫酸甲酯溶液的浓度为0.25-0.5mM。
9.根据权利要求1所述的一种活性污泥中一氧化氮还原酶提取及活性测定方法,其特征在于,步骤3中,采用在恒温培养摇床上进行震荡,温度为28-30℃,震荡转速为150-180r/min,震荡时间为20-30min。