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专利号: 2020103181610
申请人: 沈阳农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条,其特征在于,包括PVC底板(1)、以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5),所述结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的小鼠IgG抗体和Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein抗原,所述硝酸纤维素膜上设有间隔开的检测线(6)和质控线(7),检测线上包被有Kunitzprotease inhibitorprotein抗原,质控线上包被有山羊抗小鼠IgG二抗。

2.根据权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条,其特征在于,所述Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,编码所述Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原的基因是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条,其特征在于,所述Kunitzprotease inhibitorprotein抗原是如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列,编码所述Kunitz protease inhibitorprotein抗原的基因是如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条,其特征在于,所述Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原和Kunitz protease inhibitorprotein抗原的制备方法:分别构建重组表达载体pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein和pGEX-4T-1-Kunitz protease inhibitor protein,转入BL21(DE3)表达感受态中,进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后,进行蛋白大量诱导表达,利用20mM还原性谷胱甘肽洗脱与蛋白结合后的Gluthathione-Sephgrose-4B,进而获得高纯度的重组抗原。

5.一种权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1结合垫的制备:用标记量为1mg/mL的小鼠IgG抗体和25μg/mL的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein抗原对时间分辨荧光微球进行标记,然后添加2倍体积的荧光工作液进行稀释,混合均匀,喷涂在结合垫中,烘干;

S2硝酸纤维素膜的制备:将2mg/mL的Kunitz protease inhibitor protein抗原喷涂于检测线所在位置,2mg/mL的山羊抗小鼠IgG二抗喷涂于质控线所在位置,烘干;

S3试纸条的组装:样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸从左到右顺次搭接安装在PVC底板上。

6.根据权利要求5所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法,其特征在于,所述荧光工作液是0.01M磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求5所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法,其特征在于,S1和S2的喷涂步骤中,包被参数均为0.75μL/cm。

8.根据权利要求5所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法,其特征在于,采用0.1M Na2B4O7·10H2O、1%PVP、0.2%Casein-Na、1%Triton-X100、1%Tetronic 1307、0.2%NaN3,调至pH=9.3的样品垫处理液对样品垫进行处理。

9.一种权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的使用方法,其特征在于,血清与样品缓冲液按体积比1:2稀释后得到血清待检样本,取75μL血清待检样本,滴加在样品垫上,15min后,用紫外灯照射试纸条观察结果,如果检测线和质控线均显色,证明该样品为阳性;如果检测线不显色,质控线显色,证明该样品为阴性。

10.根据权利要求9所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的使用方法,其特征在于,所述样品缓冲液为pH=7.8的0.05M Tris-HCl、0.9%NaCl、1.5%BSA、

0.01%Tween-20、0.1%NaN3。