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专利号: 2019113783695
申请人: 天津农学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物,其特征在于:所述引物的核苷酸序列如下:RD-F:SEQ NO.1;

RD-R:SEQ NO.2。

2.一种利用如权利要求1所述的基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法,其特征在于:步骤如下:⑴提取待测细菌样品DNA;

⑵以步骤⑴中所提取的DNA为模板,采用荧光定量PCR方法扩增雷氏普罗威登斯菌rtxD基因,其中所使用引物的核苷酸序列为RD-F和RD-R,在58-61℃退火阶段根据荧光信号积累确定Cq值,在扩增条件后增加65℃至95℃,进行融解曲线分析;

⑶雷氏普罗威登斯菌的标准曲线的绘制:根据所选用的重组质粒作为模板,进行荧光定量扩增,绘制标准曲线;

⑷实验结果判定标准:若阴性对照品无Cq值,且无规则扩增曲线,同时Cq值应在15-35之间,扩增曲线规则,判断为阳性,并将所得Cq值在步骤⑶中所得标准曲线上确定样品中雷氏普罗威登斯菌的数量;反之,判断为阴性。

3.根据权利要求2所述的利用荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法,其特征在于:所述步骤⑵中荧光定量PCR方法中使用的荧光染料为TB Green II。

4.根据权利要求2所述的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法,其特征在于:所述步骤⑶中重组质粒DNA的浓度为1.0×103-1.0×107拷贝/反应,绘制标准曲线,E=99.1%,R2=0.999。

5.根据权利要求2所述的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法,其特征在于:所述步骤⑵的具体步骤为:以步骤⑴中所提取的DNA为模板,采用荧光定量PCR方法扩增雷氏普罗威登斯菌rtxD基因,体系为Green Premix Ex Taq II 10μL,10μmol/L上下游引物各0.5μL,DNA模板2μL,使用DEPC水补足至20μL;

采用两步法进行荧光定量PCR扩增,PCR反应条件为:95℃3min;95℃10s,58-61℃1min,

40个循环;

72℃延伸2min,在退火阶段根据荧光信号积累确定Cq值,在扩增条件后增加65℃至95℃,进行融解曲线分析。

6.根据权利要求2所述的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法,其特征在于:所述步骤⑶中重组质粒的制备如下:提取雷氏普罗威登斯菌的总DNA,使用引物序列RD-F和RD-R进行PCR扩增:PCR扩增反应体系为25μL:Taq PCR Mix 10μL;RD-F 1μL,RD-R 1μL;DNA模板2μL;用ddH2O补足到25μL;

PCR反应条件为:95℃5min;95℃30s,58-61℃40s,72℃1min 30个循环;72℃再延伸

10min;

回收目的条带并与pM18-T连接、转化、鉴定正确后测序,经测序分析,雷氏普罗威登斯菌rtxD基因序列扩增正确;

将所得含有重组质粒的大肠杆菌在37℃,150r/min的摇床中培养12-16h,提取质粒,即可用作荧光定量PCR扩增的模板的重组质粒。

7.根据权利要求2至6任一项所述的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法,其特征在于:所述步骤⑶中绘制标准曲线的具体步骤如下:使用重组质粒作为荧光定量PCR扩增的模板,经10倍梯度稀释,得到不同浓度的DNA模板:1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103拷贝/反应;

采用荧光定量PCR方法扩增,体系为Green Premix Ex Taq II 10μL,10μmol/L上下游引物各0.5μL,DNA模板2μL,使用DEPC水补足至20μL;

采用两步法进行荧光定量PCR扩增,PCR反应条件为:95℃3min;95℃10s,58-61℃1min,

40个循环;

72℃延伸2min,在退火阶段根据荧光信号积累确定Cq值,在扩增条件后增加65℃至95℃,进行融解曲线分析,每个样本三个平行;

进行荧光定量PCR后得到每个浓度的Cq值,以拷贝数log10值和Cq值制作细菌悬液的标准曲线,E=99.1%,R2=0.999。

8.如权利要求2至7任一项所述的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法在检测雷氏普罗威登斯菌所导致疾病方面中的应用。