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专利号: 2019111746441
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种促进重组枯草芽孢杆菌中N‑乙酰氨基葡萄糖合成的方法,其特征在于,所述方法是重组枯草芽孢杆菌使用GlcN6P感应元器件控制N‑乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径;同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf,pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化;所述GlcN6P感应元器件由转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子组成,所述转录因子GamR的氨基酸序列为NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1‑235位,所述启动子是PgamA启动子;同时敲除了副产物乙偶姻合成关键基因alsSD;所述启动子PgamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;

所述N‑乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述N‑乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1以载体pSTg‑GNA1为表达载体,所述载体pSTg‑GNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

所述的重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNY‑Pveg‑glmS‑P43‑GNA1为出发菌株;

所述出发菌株以枯草芽孢杆菌168为基础,基因型作如下改造得到的:ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72,并以启动子Pveg调控表达来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB与枯草芽孢杆菌168自身的glmS、在质粒上以启动子P43调控GNA1的重组表达。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述dCas9蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.21所示;所述dCas9蛋白以载体pLCg‑dCas9为表达载体进行整合表达,所述载体pLCg‑dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述作用于zwf的sgRNA表达片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示;所述作用于pfkA的sgRNA表达片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示;所述作用于glmM的sgRNA表达片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示;所述sgRNA的表达片段通过转化载体psga‑zpg整合到重组枯草芽孢杆菌基因组上,所述载体psga‑zpg的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的乙偶姻合成途径关键基因alsSD的敲除是通过转化alsSD敲除框实现的,敲除框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌使用GlcN6P感应元器件控制N‑乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径;同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf,pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化;所述GlcN6P感应元器件由转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子组成,所述转录因子GamR的氨基酸序列为NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1‑235位,所述启动子是PgamA启动子;同时敲除了副产物乙偶姻合成关键基因alsSD;所述启动子PgamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;

所述N‑乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述N‑乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1以载体pSTg‑GNA1为表达载体,所述载体pSTg‑GNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

所述的重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNY‑Pveg‑glmS‑P43‑GNA1为出发菌株;

所述出发菌株以枯草芽孢杆菌168为基础,基因型作如下改造得到的:ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72,并以启动子Pveg调控表达来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB与枯草芽孢杆菌168自身的glmS、在质粒上以启动子P43调控GNA1的重组表达。

6.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法,其特征在于,所述方法是将权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌置于35‑39℃、200‑220 rpm下培养10‑15 h的种子以1‑10%的接种量转入摇瓶发酵培养基,35‑39℃、200‑220 pm条件下培养50‑70 h;或,所述方法是将权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌置于35‑39℃、200‑220 rpm下培养10‑15 h的种子以1‑10%的接种量转入上罐发酵培养基,于装液量为30‑50%的发酵罐中,35‑39℃、pH 6.5‑7.5条件下培养,通气量为1‑2 vvm,转速控制在500‑900 rpm之间维持溶氧在30%以上,持续流加750 g/L以控制葡萄糖浓度在1‑30 g/L之间。

7.权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求1‑4任一所述方法在制备食品、药物、营养保健品或者化妆品中的应用。