1.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP,其特征在于:是将疫苗株SP的T3448A位点突变得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP,其特征在于:编码所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法,其特征在于包括以下步骤:(1)以疫苗株SP的cDNA作为模板,扩增横跨重组疫苗株PRRSV-SP全基因组的A、B、C、D 4个片段,克隆入质粒中,得到重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D;在构建过程中,对片段做以下改造:
1)将酶切位点BsmBI、NotI以及T7启动子引入A片段的始端;
2)将B片段在3448nt位的T核苷酸通过一个点突变换成A以消除在此位点的BsmBI酶切位点,此位点同时作为重组疫苗株PRRSV-SP的一个标记位点;
3)将酶切位点BsmBI分别引入D片段的始端和末端;
(2)将步骤(1)得到的重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D扩增,提取质粒,采用BsmBI酶切,回收对应片段,用T4 DNA连接酶进行连接,得到5’端含T7启动子,3’端含35个碱基A的重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA;
(3)将步骤(2)得到的重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA纯化,之后作为模板进行体外转录,得到全长转录本,即为重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA;
(4)将步骤(3)得到的重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA电转染细胞,培养,当细胞出现50%以上凋亡时-80℃冻融三次,离心,取上清,即得到重组疫苗株PRRSV-SP。
4.根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的片段A覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第1~3130位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段B覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第3058~5720位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段C覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第5690~10581位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段D覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第10576~15520位核苷酸;
步骤(1)中所述的质粒为pCR-TOPO-2.1或pCR-XL-TOPO。
5.根据权利要求4所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的片段A适用的质粒为pCR-TOPO-2.1;适用的引物如下:F1:5’-gcgtctcgcggccgctaatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’;
R1:5’-cacttcaagaacgtccccgt-3’;
步骤(1)中所述的片段B适用的质粒为pCR-TOPO-2.1;适用的引物如下:F2:5’-gtctgcatcctcgcatactg-3’;
R2:5’-gaagggacccgagctgagac-3’;
步骤(1)中所述的片段C适用的质粒为pCR-XL-TOPO;适用的引物如下:F3:5’-ctgtttaccccgtctcagct-3’;
R3:5’-gcgtctcatcacagatattctgtcc-3’;
步骤(1)中所述的片段D适用的质粒为pCR-XL-TOPO;适用的引物如下:F4:5’-gcgtctctgtgatgccatccagcc-3’;
R4:5’-gcgtctctttttt(30)aatttcggccgcatggttt-3’。
6.根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的扩增是将重组质粒转化入大肠杆菌中进行扩增;
步骤(2)中所述的连接所用的各片段的摩尔浓度相同;
步骤(3)中所述的纯化是采用苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化;
步骤(3)中所述的体外转录的反应体系和反应条件为:5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP(CAP:GTP=1:3)10μL、30mMGTP1.5μL,模板2.5μL、T7RNA聚合酶2uL,37℃孵育3h;
步骤(4)中所述的细胞的制备步骤如下:用含体积比为10%FBS的MEM培养基培养Marc-
145或BHK21细胞生长密度达到90%,胰酶消化,采用预冷的PBS悬浮,4℃条件下500g离心
5min,弃上清,用预冷的PBS悬浮,重复离心一次,弃上清,采用预冷的PBS重悬细胞;
所述的PBS的配制:80mM Na2HPO4、20mM NaH2PO4、100mM NaCl,pH7.5;
步骤(4)中所述的电转染细胞的条件如下:4mm电击杯、450V、50μF条件下进行一次脉冲;
步骤(4)中所述的培养是将含体积比为2%的FBS的DMEM培养基加入电转后的细胞,培养3~4天得到;
步骤(4)中所述的重组疫苗株PRRSV-SP于-80℃保存。
7.权利要求1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP在研究PRRSV毒株变异机制和/或制备弱毒疫苗中的应用;
所述的制备弱毒疫苗包括利用利用弱毒疫苗株的复制酶系统和高致病性毒株的结构蛋白区域之间的嵌合互补作用来开发抗PRRSV同源以及异源毒株的新型高效广谱疫苗。
8.一株嵌合毒株vSP-Hub2,其特征在于:利用权利要求1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP制备得到;
所述的嵌合毒株vSP-Hub2的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
9.权利要求8所述的嵌合毒株vSP-Hub2的制备方法,其特征在于包括以下步骤:(1)扩增横跨嵌合毒株vSP-Hub2全基因组的A、B、C、D1、Hub2、N6个片段,克隆入质粒中,得到重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N;在构建过程中,对片段做以下改造:
1)将酶切位点BsmBI、Not I以及T7启动子引入A片段的始端;
2)在D1片段的始端和片段N的末端分别引入一个BsmBI酶切位点;
3)将片段Hub2放入重组疫苗株PRRSV-SP的相应编码区域13897-15008nt;
(2)将步骤(1)得到的重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N扩增,提取质粒,酶切,回收,连接,得到5’端含T7启动子,3’端含35个碱基A的嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA;
(3)将步骤(2)得到的嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA纯化,体外转录,得到重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA,电转至细胞,培养,当细胞出现50%以上凋亡时-80℃冻融3次,取上清感染细胞,重复冻融和感染的步骤3次,取上清,即得嵌合毒株vSP-Hub2;
步骤(1)中所述的片段A、片段B、片段C、片段D1、片段Hub2和片段N是以cDNA为模板,采用特异性引物和高保真DNA聚合酶扩增得到;
步骤(1)中所述的片段A覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第1~3130位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段B覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第3058~5720位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段C覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第5690~10581位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段D1覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第10576~13902位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段Hub2覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第13897~15008位核苷酸;
步骤(1)中所述的片段N覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第15004~15520位核苷酸;
步骤(1)中所述的载体为pCR-TOPO-2.1、pCR-XL-TOPO、pUCIDT或pGEM;
步骤(1)中所述的片段A适用的质粒为pCR-TOPO-2.1;
步骤(1)中所述的片段B适用的质粒为pCR-TOPO-2.1;
步骤(1)中所述的片段C适用的质粒为pCR-XL-TOPO;
步骤(1)中所述的片段D1适用的质粒为pGEM;
步骤(1)中所述的片段Hub2适用的质粒为pUCIDT;
步骤(1)中所述的片段N适用的质粒优选为pGEM;
所述的特异性引物按照A、B、C、D1、N5个片段的顺序依次如下:F5:5’-gcgtctcgcggccgctaatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’;
R5:5’-cacttcaagaacgtccccg-3’t;
F6:5’-gtctgcatcctcgcatactg-3’;
R6:5’-gaagggacccgagctgagac-3’;
F7:5’-ctgtttaccccgtctcagct-3’;
R7:5’-gcgtctcatcacagatattctgtcc-3’;
F8:5’-gcgtctctgtgatgccatccagcc-3’;
R8 5’-atcgtctccaacatacttaaacattc-3’;
F9:5’-aacgtctcaaataacaacggcaaac-3’;
R9:5’--gcgtctctttttt(30)aatttcggccgcatggttt-3’;
所述的cDNA是以提取的疫苗株SP的RNA为模板,逆转录获得;
步骤(2)中所述的酶切具体为:重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C以及重组质粒N采用BsmBI酶切;重组质粒D1采用BsmBI和ScaI双酶切;重组质粒Hub2采用BsaI酶切;
步骤(2)和(3)中所述的扩增、连接纯化、体外转录、电转以及培养的步骤与所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法中的步骤相同。
10.权利要求8所述的嵌合毒株vSP-Hub2在研究PRRSV毒株变异机制和/或制备弱毒疫苗中的应用。