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专利号: 201911070649X
申请人: 山东农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2025-12-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种纳米酶标记仿生免疫分析检测磺胺嘧啶的方法,其特征在于,以纳米酶标记抗原代替天然酶标记抗原,以分子印迹聚合物代替生物抗体;其中:所述纳米酶标记抗原由如下方法制备而成:

将6~9mL的十六烷基三甲基溴化铵与100μL的氯金酸溶液混匀,用去离子水稀释至8~

10mL,在搅拌条件下加入硼氢化钠溶液,搅拌3~10分钟后静置,得到金种子溶液;

将制备的金种子溶液加入到由0.1M的CTAB、0.024M的HAuCl4、0.5M的H2SO4、10mM的AgNO4和0.1mM的左旋抗坏血酸溶液按体积比100mL:(2-2.1)mL:2mL:1mL:800μL组成的生长液中,在25~37℃环境下反应10~18h,制备得到纳米金棒;

将纳米金棒用去离子水配制成溶液,用NaOH溶液将纳米金棒溶液的pH调节至9~11,每隔30分钟加入10~30μL硅酸四乙酯/乙醇溶液,一共加三次,30℃水浴24h,制备得到表面包覆二氧化硅层的纳米金棒;

将表面包覆二氧化硅层的纳米金棒进行氨基化处理,然后对磺胺嘧啶进行标记,即制备得到纳米酶标记抗原;

所述分子印迹聚合物膜由如下方法制备而成:

0.251g磺胺嘧啶溶于16mL乙腈中,然后加入0.253g甲基丙烯酸,磁力搅拌10~30min后加入1~3mL二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.01~0.04g偶氮二异丁腈,磁力搅拌1h;96孔酶标板上每孔加入200μL上述混合溶液,在氮气环境下,30~37℃水浴反应16~18h;用体积比为9:

1的甲醇-醋酸溶液超声8h除去磺胺嘧啶,再用浓度100%甲醇洗4h至中性,37℃干燥2h后得到带有分子印迹聚合物膜的酶标板。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述纳米酶标记仿生免疫分析检测磺胺嘧啶,具体包括以下步骤:(1)将带有分子印迹聚合物膜的酶标板的第1行设为空白组,每孔只加入200μL的甲醇;

第2行设置为对照组,每孔加入100μL的纳米酶标记抗原溶液和100μL的甲醇;第3-8行每孔加入磺胺嘧啶标样梯度稀释液和100μL的纳米酶标记抗原溶液;室温竞争反应1h,加入TMB底物溶液进行显色反应,用酶标仪在450nm处读取紫外吸收值,计算抑制率;以磺胺嘧啶标样浓度对数值为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制工作曲线;

(2)利用步骤(1)绘制的工作曲线对经前处理的待测物中的磺胺嘧啶的含量进行检测;

步骤(2)中,所述待测物的前处理方法为:将待测物用乙酸乙酯涡旋离心重复提取2~4次,合并提取液并在40℃下旋转蒸发,残余物用甲醇溶解,0.22μm滤膜过滤;所述待测物与乙酸乙酯加入量的比为1g:(3~5)mL。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述磺胺嘧啶标样梯度稀释液由甲醇配成而成,其梯度浓度分别为:0.0512mg/L、0.256mg/L、1.28mg/L、6.4mg/L、32mg/L和160mg/L。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述抑制率的计算公式为:%CR=(1-A/Ao)×100

其中,A表示标准液或样液的平均吸光度;Ao表示对照孔的平均吸光度。