1.一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:a)前处理:将细点圆趾蟹下脚料粉碎,然后进行脱脂处理、干燥粉碎后制得脱脂下脚料;
b)酶解:将脱脂下脚料加入水制得混合物,液料比为3~5:1,然后向其中加入0.3~
0.4wt%ProteAX peptidase在45~55℃酶解处理4~5小时,制得酶解液;
c)酶解后处理:酶解液灭酶,然后离心处理得到上清液A,将上清液A蒸发浓缩并冷冻干燥制得抗菌肽粗品;
d)提纯:将抗菌肽粗品用三氟乙酸溶解,离心处理制得上清液B,然后用C18固相萃取柱进行富集,收集合并具有抑菌活性的洗脱液,再用葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化,收集合并具有抑菌活性的洗脱峰,最后将具有抑菌活性肽真空浓缩后再经C18色谱柱进行分离纯化,收集合并具有抑菌活性的洗脱峰,制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽;
所述步骤d)中,C18固相萃取柱洗脱时,分别依次采用洗脱液含0.1wt%TFA的30wt%乙腈溶液和含0.1wt%TFA的50wt%乙腈溶液进行洗脱,流速为1.0~2.0mL/min,收集含
0.1wt%TFA的50wt%乙腈溶液洗脱的洗脱液;
所述步骤d)中,葡聚糖凝胶柱洗脱时,上样量为5mL,洗脱液为超纯水,洗脱速度为1.0~2.0mL/min,收集合并洗脱48~51分钟区间内的洗脱峰即得洗脱抗菌肽;
所用葡聚糖凝胶柱为Sephadex G‑15色谱柱。
2.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法,其特征在于:所述步骤a)前处理具体为,将细点圆趾蟹下脚料粉碎,然后将下脚料按液料比4~6:1在无水乙醇和正己烷混合溶剂中脱脂处理60~90分钟,脱脂处理时温度为45~55℃,抽滤后滤饼在75~85℃下干燥5.5~6.5小时,制得下脚料粉。
3.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法,其特征在于:所述步骤b)酶解前先将混合物的pH值调至7.8~8.6并在45~55℃水浴中处理0.5~
1.5小时。
4.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法,其特征在于:所述步骤c)具体为,将酶解液在90~100℃下灭酶处理10~20分钟,然后经流水冷却至室温,以4000~6000rpm的转速离心处理8~13分钟得到上清液A,将上清液A在45~55℃下蒸发浓缩至固形物含量不小于70wt%,‑18℃冷冻5h,真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品。
5.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法,其特征在于:所述步骤d)中,三氟乙酸的浓度为0.08~0.12wt%。
6.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法,其特征在于:所述步骤d)中,离心处理的转速为8000~12000rpm,处理时间为5~15分钟。
7.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法,其特征在于:C18色谱柱进行分离纯化时,检测波长为220nm,进样量100μL,流速1~2mL/min,流动相为乙腈和含0.1%三氟乙酸溶液,洗脱方式为梯度洗脱,在30分钟内乙腈含量有30wt%升高到55wt%,收集合并洗脱时间为18~20分钟区间内的洗脱峰,制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。