欢迎来到知嘟嘟! 联系电话:13095918853 卖家免费入驻,海量在线求购! 卖家免费入驻,海量在线求购!
知嘟嘟
我要发布
联系电话:13095918853
知嘟嘟经纪人
收藏
专利号: 2019107160324
申请人: 南京昊斯亭网络科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-04-19
缴费截止日期: 暂无
价格&联系人
年费信息
委托购买

摘要:

权利要求书:

1.一种植物病害菌总DNA的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:S1取菌体样本在LB+0.4%Gly液体培养基中混合36~60h后,3000~5000rpm离心收集菌体,用15~20ml STE缓冲液洗涤菌体,得悬浮液;

S2取S1得到的悬浮液0.5~1g,加入15mL STE缓冲液,涡旋混匀;称取溶菌酶粉末溶解于悬浮液,使其浓度为2.8~3.4 mg/mL,混匀,放到37℃、200rpm恒温培养箱中反应3~4h,得混合液Ⅰ;

S3在S2得到的混合液Ⅰ中同时加入200μL 10mg/mL的蛋白酶K和20%SDS 1.5mL,混匀后,放入50~70℃水浴中反应1h以上,得混合液Ⅱ;

S4在S3得到的混合液Ⅱ中加入2.5~3.5 mL的5M NaCl,充分混匀,使NaCl的最终浓度为0.8M,得混合液Ⅲ;

S5在S4得到的混合液Ⅲ中加入1.90~2mL CTAB/NaCl溶液,在68℃水浴下充分混匀10min,得混合液Ⅳ;

S6在S5得到的混合液Ⅳ加入等体积量的氯仿混匀,离心后将取上清液,重复上述动作2次,得上清液Ⅰ;

S7在S6得到的上清液Ⅰ中加入等体积量的苯酚-氯仿混匀,离心,用剪枪头小心的吸取上清液,重复上述动作2次,得上清液Ⅱ;

S8在S7得到的上清液Ⅱ加入等体积量的氯仿混匀,离心后取上清液Ⅲ;

S9在S8得到的上清液Ⅲ中加入3M NaAc pH5.2、异丙醇、70%的乙醇、1×TE缓冲液、10%SDS、 10 mg/mL蛋白酶K以及无水乙醇,除去所述上清液Ⅲ中的杂质,得到病害菌总DNA;

所述LB+0.4%Gly液体培养基为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物 5g/L、氯化钠NaCl 10g/L,用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4,加入0.4%Gly溶解所得;

所述STE缓冲液为20 mM Tris-HCl、10 mM EDTA、100 mM NaCl、pH=7.5;

所述20%SDS溶液为20gSDS、100ml蒸馏水,溶解所得;

所述10%SDS溶液为10gSDS、100ml蒸馏水,溶解所得;

所述CTAB/NaCl溶液为10 %的CTAB溶解于0.7 M的NaCl;

所述苯酚-氯仿为250 ml Tris 饱和酚与250 ml 氯仿混合均匀,置于4℃冰箱分层,备用;

所述1×TE缓冲液为10mMTris-HCl、1mM EDTA、 PH=8.0;

在所述S9中,除去所述上清液Ⅲ中杂质的操作具体包括以下步骤:

A.上清液中加入1/10体积3M NaAc,pH 5.2已预冷,混匀后加等体积异丙醇已预冷混匀,放在冰上使DNA螺旋成白色的团,其间小心的上下翻动;

B.用枪头挑出DNA放入2 mL的EP管中,用1.5 mL 70%的乙醇洗涤2~3次,晾至半干状态,用1mL 1×TE缓冲液溶解DNA,加入5μL 10 mg/mL的RNA酶,放在4℃冰箱过夜溶解;

C.将溶解好的DNA从4℃冰箱拿出来,加入2μL 10%SDS及8μL 10 mg/mL蛋白酶K,55℃水浴反应1 h以上,冷却至室温后,加入1/10体积3M NaAc,pH 5.2已预冷,混匀后,加入2倍体积的无水乙醇在冰上沉淀得DNA。

2.如权利要求1所述的一种植物病害菌总DNA的提取方法,其特征在于,在所述S6、S7、S8中所述混匀为上下颠倒混匀变成一相。

3.如权利要求1所述的一种新型的植物病害菌总DNA的提取方法,其特征在于,在所述S6、S7、S8中,12000~14000rpm离心10~15 min。