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专利号: 2019106846793
申请人: 长江大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-28
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种大豆基因组DNA提取试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于裂解细胞的裂解液,所述裂解液包括高盐高PH提取液和2%的β‑巯基乙醇;其中所述高盐高PH提取液包括总溶液以及十二烷基硫酸钠;

所述总溶液包括:终浓度为35mM的六水合氯化镁,终浓度为400mM的氯化钾,终浓度为

200mM的蔗糖,终浓度为200mM的Tris‑base,终浓度为25mM的EDTA·2Na;将总溶液配制完成后,调节pH至9.0,然后加入质量与所述总溶液体积比为10%的十二烷基硫酸钠,即得所述高盐高PH提取液。

2.如权利要求1所述的大豆基因组DNA提取试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于去除杂质的清洗液;以及用于洗脱DNA的洗脱液。

3.如权利要求2所述的大豆基因组DNA提取试剂盒,其特征在于,所述清洗液包括酚氯仿异戊醇,氯仿异戊醇,醋酸钠,无水乙醇,75%乙醇;所述酚氯仿异戊醇中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1;所述氯仿异戊醇中氯仿、异戊醇的体积比为24:1。

4.如权利要求2所述的大豆基因组DNA提取试剂盒,其特征在于,所述洗脱液包括10mM,pH=8.0的Tris或者pH=8.0的超纯水中的任意一种。

5.一种大豆基因组DNA提取方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:步骤1、溶液的配制:分别配制好裂解液,清洗液以及洗脱液;所述裂解液包括高盐高PH提取液和2%的β‑巯基乙醇;所述高盐高PH提取液包括总溶液以及十二烷基硫酸钠;所述总溶液包括:终浓度为35mM的六水合氯化镁,终浓度为400mM的氯化钾,终浓度为200mM的蔗糖,终浓度为200mM的Tris‑base,终浓度为25mM的EDTA·2Na,将总溶液配制完成后,调节pH至9.0,然后加入质量与所述总溶液体积比为10%的十二烷基硫酸钠,即得所述高盐高PH提取液;

步骤2、原材料的处理:将大豆幼嫩叶片或大豆种子经处理得到大豆粉;

步骤3、DNA的提取:在大豆粉中加入所述高盐高PH提取液,颠倒混匀后加入所述2%的β‑巯基乙醇,液氮冷冻后37℃水浴,待其溶解为冰水混合物后振荡 ,再反复冻融2~6次;

步骤4、杂质的去除:加入清洗液去除杂质,其中所述清洗液包括:酚氯仿异戊醇;氯仿异戊醇;3M,pH5.2的醋酸钠;3M,pH5.6的醋酸钠;无水乙醇;75%乙醇;所述酚氯仿异戊醇中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1;所述氯仿异戊醇中氯仿、异戊醇的体积比为24:1;

步骤5、大豆基因组DNA的溶解:杂质去除后风干,加入洗脱液溶解即可。

6.如权利要求5所述大豆基因组DNA提取方法,其特征在于,所述步骤2中,将采集的大豆幼嫩叶片放入离心管中,放入0.5cm直径的钢珠,放入液氮中冷冻后在高通量研磨仪上打碎,得到大豆粉放入‑80℃冰箱保存;或挑取干燥的大豆种子,打碎,过筛后得到大豆粉常温保存备用。

7.如权利要求5所述大豆基因组DNA提取方法,其特征在于,所述步骤4具体包括:S1、加入所述酚氯仿异戊醇,剧烈震荡后静置分层,12000rmp,4℃离心10分钟;

S2、吸取上清,加入所述氯仿异戊醇,剧烈震荡后静置分层,12000rmp,4℃离心10分钟;

再重复此步骤一次;

S3、取上清,加入1/10体积的所述3M,pH5.2的醋酸钠,混匀,然后加入2.5倍溶液体积预冷乙醇,混匀,静置5分钟,沉淀核酸;8000rpm离心5分钟,弃上清,保留沉淀;

S4、往沉淀中加入所述3M,pH5.6的醋酸钠,溶解沉淀5分钟,然后8000rpm 离心5分钟;

S5、将上清转入新的离心管,加入溶液3倍体积预冷的无水乙醇,静置5分钟,待DNA充分沉淀后,12000rpm离心20分钟;

S6、弃上清,用75%乙醇洗涤DNA 2次。

8.如权利要求5所述大豆基因组DNA提取方法,其特征在于,所述步骤3中,所述振荡采用高通量研磨仪,震荡时间为3分钟,振荡频率为50HZ/min。