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专利号: 2019106425578
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感器包括末端转移酶、生物素化的双脱氧核苷酸、生物素化的核苷酸、荧光标记的核苷酸、DNA糖基化酶、AP内切核酸酶1、链霉抗生物素蛋白包被的磁珠和核酸外切酶Exo I;

所述DNA损伤的类型为8‑oxoG、尿嘧啶或脱氧肌苷;

所述DNA糖基化酶与待测DNA损伤具体类型相对应;

当检测8‑oxoG引起的DNA损伤时,所述DNA糖基化酶为甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶;

当检测尿嘧啶引起的DNA损伤时,所述DNA糖基化酶为尿嘧啶DNA糖基化酶;

当检测脱氧肌苷引起的DNA损伤时,所述DNA糖基化酶为人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶;

所述生物素化的双脱氧核苷酸为Biotin‑ddATP;

所述生物素化的核苷酸为Biotin‑dNTP;

所述荧光标记的核苷酸为Cy5修饰的ddUTP。

2.如权利要求1所述的荧光化学传感器,其特征在于,所述DNA损伤包括孤立的损伤位点和聚集的损伤位点。

3.一种非诊断目的的使用权利要求1‑2任一项所述荧光化学传感器检测基因组中DNA损伤的方法,其特征在于,所述DNA损伤的类型为8‑oxoG、尿嘧啶或脱氧肌苷;

所述方法包括:

S1、向待测物中加入生物素化的双脱氧核苷酸和末端转移酶进行孵育,然后加入链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行分离;

S2、加入DNA糖基化酶和AP内切核酸酶1进行孵育处理;

S3、加入生物素化的核苷酸和末端转移酶进行孵育处理;

S4、通过磁力分离将混合物洗涤三次,向分离的生物素化的DNA链中加入荧光标记的核苷酸和末端转移酶避光孵育处理,经磁分离和外切酶消化,进行单分子成像;

所述步骤S2中,所述DNA糖基化酶与待测DNA损伤具体类型相对应;

当检测8‑oxoG引起的DNA损伤时,所述DNA糖基化酶为甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶;

当检测尿嘧啶引起的DNA损伤时,所述DNA糖基化酶为尿嘧啶DNA糖基化酶;

当检测脱氧肌苷引起的DNA损伤时,所述DNA糖基化酶为人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶;

所述生物素化的双脱氧核苷酸为Biotin‑ddATP;

所述生物素化的核苷酸为Biotin‑dNTP;

所述荧光标记的核苷酸为Cy5修饰的ddUTP;

所述外切酶为Exo I。

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中,孵育具体条件为:35~40℃下孵育处理0.5~1.5小时。

5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中,孵育具体条件为:37℃下孵育处理1小时。

6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤S2中,孵育具体条件为:35~40℃下孵育处理0.5~1.5小时。

7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤S2中,孵育具体条件为:37℃下孵育处理1小时。

8.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤S3中,孵育具体条件为:35~40℃下孵育处理0.4~1小时。

9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述步骤S3中,孵育具体条件为:37℃下孵育处理0.5小时。

10.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤S4中,避光孵育具体条件为:35~40℃下孵育处理0.5~1.5小时;

所述单分子成像为全内反射荧光单分子成像,640nm激光用于激发Cy5分子,对Cy5分子进行计数从而实现对DNA损伤的定量检测。

11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述步骤S4中,孵育具体条件为:37℃下孵育处理1小时。