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专利号: 2019106422298
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶,其特征在于所述共固定化酶由按下方法制备获得:(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中,得到基因工程菌经发酵培养,获得湿菌体悬浮于的pH 6.9~7.1缓冲液中得到菌悬液,菌悬液经细胞破碎、离心,得到羰基还原酶粗酶液;

(2)氨基树脂加入pH7.8~8.2的磷酸缓冲液,置于25~30℃摇床15~20min,维持pH7.8~8.2,1h后过滤抽干,加入至2~3%的戊二醛磷酸缓冲溶液中,25~30℃摇床60~80min,过滤,去离子水洗涤,得到处理后的氨基树脂;

(3)粗酶液中加入步骤(2)预处理后的氨基树脂,氨基树脂添加量为15~100g/100L粗酶液;

(4)在20~30℃、200~300rpm条件下水浴搅拌固定化6~8h,再加入辅酶NADP+固定化10~12h,抽滤,滤饼用pH 7.0磷酸钾盐缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,即得所述羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶。

2.如权利要求1所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶,其特征在于所述氨基树脂为下列之一:LX-1000NH,LX-1000EPHA,LX-1000EPH,LX-1000HAA,LX-1000HA(A),ESR-3,LX-HFA。

3.如权利要求2所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶,其特征在于所述氨基树脂为LX-1000HAA。

4.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶,其特征在于步骤(1)粗酶液按如下方法制得:将羰基还原酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基,

37℃、200rpm下培养8h,再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,于37℃、150rpm下培养至菌体OD600达0.6~0.8,加入终浓度为

0.1mM的IPTG,28℃下诱导培养10h后,4℃、8000rpm离心10min,弃去上清液,收集湿菌体;取

1g湿菌体,悬浮于10mL pH7.0、100mM磷酸钾盐缓冲液中,在冰浴中超声破碎或者使用高压匀浆机进行细泡破碎,破碎液离心,取上清液即为粗酶液。

5.制备权利要求1~4之一所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶的方法,其特征在于所述方法如下:(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中,得到基因工程菌经发酵培养,获得湿菌体悬浮于的pH 6.9~7.1缓冲液中得到菌悬液,菌悬液经细胞破碎、离心,得到羰基还原酶粗酶液;

(2)氨基树脂加入pH7.8~8.2的磷酸缓冲液,置于25~30℃摇床15~20min,维持pH7.8~8.2,1h后过滤抽干,加入至2~3%的戊二醛磷酸缓冲溶液中,25~30℃摇床60~80min,过滤,去离子水洗涤,得到处理后的氨基树脂;所述氨基树脂为下列之一:LX-1000NH,LX-

1000EPHA,LX-1000EPH,LX-1000HAA,LX-1000HA(A),ESR-3,LX-HFA;

(3)粗酶液中加入步骤(2)预处理后的氨基树脂,氨基树脂添加量为15~100g/100L粗酶液;

+

(4)在20~30℃、200~300rpm条件下水浴搅拌固定化6~8h,再加入辅酶NADP固定化10~12h,抽滤,滤饼用pH 7.0磷酸钾盐缓冲液清洗两次,抽滤去除缓冲液,即得所述羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶。

6.权利要求1~4之一所述的羰基还原酶-辅酶NADP+共固定化酶在不对称还原制备(3R,

5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述应用为:以羰基还原酶基因工程菌共固定化酶为催化剂,加入以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物,以异丙醇为辅底物,以pH值为7.0的磷酸钾缓冲液或正己烷为反应介质构成反应体系,在15~65℃、200~800rpm条件下反应18~24h,反应完全后,将混合液抽滤回收固定化酶,滤液分离纯化,得到所述(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于:所述催化剂用量为15~100g/L反应体系,异丙醇体积用量为10~80%,底物终浓度200g/L反应体系。