1.一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法，其特征在于：将巨大口蘑和双孢蘑菇活化，得到的菌丝体分别酶解，获得其原生质体，纯化，以巨大口蘑原生质体紫外灭活，双孢蘑菇原生质体热灭活做为标记，采用PEG介导的化学融合方法将巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇的原生质体融合，融合子再生，获得融合菌株；

所述的菌丝体分别酶解所采用的酶液均为纤维素酶和蜗牛酶的混合酶液；

所述的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇的原生质体融合是将灭活处理的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体混合，预热，加入PEG缓冲液，水浴融合，得到原生质体融合物悬液，离心，弃上清液，洗涤；

所述的巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法，具体包括如下步骤：（1）菌丝体制备

在PDA培养基上取2～3片1.2 cm最前端生长旺盛的巨大口蘑菌丝块，接种于160 mL液体PDA培养基中，30℃、160 r/min培养7～10 d，得到菌丝球，将菌丝球转移到160 mL液体PDA培养基中，30℃静置培养4 d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到巨大口蘑菌丝体；

在PDA培养基上取2～3片1.2 cm最前端生长旺盛的双孢蘑菇菌丝块，接种于160 mL液体PDA培养基中，26℃、160 r/min培养7～10 d，得到菌丝球，将菌丝球转移到装有160 mL液体PDA培养基中，26℃静置培养4 d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到双胞蘑菇菌丝体；

（2）原生质体制备

将步骤（1）得到的巨大口蘑菌丝体采用纤维素酶浓度为质量体积比5%、蜗牛酶浓度为质量体积比5%的巨大口蘑混合酶液进行酶解，得到巨大口蘑酶解液；双孢蘑菇采用纤维素酶浓度为质量体积比7.6%、蜗牛酶浓度为质量体积比4%的双孢蘑菇混合酶液进行酶解，得到双孢蘑菇酶解液；

（3）原生质体纯化

将步骤（2）中得到的巨大口蘑酶解液和双孢蘑菇酶解液过滤去除菌丝残片，洗涤，离心，去上清液，收集原生质体，洗涤，重悬，得到纯化的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体悬液；

（4）原生质体灭活

将步骤（3）中得到的纯化的巨大口蘑原生质体采用紫外灭活处理；将步骤（3）中得到的纯化的双孢蘑菇原生质体采用热灭活处理；

（5）原生质体融合：

将步骤（4）中灭活处理的巨大口蘑原生质体悬液和双孢蘑菇原生质体悬液混合，30℃预热5 min，加入质量体积比为30%的PEG缓冲液，迅速置于30℃水浴30min融合，得到原生质体融合物悬液， 3000 r/min离心15 min，弃上清液，洗涤，得到原生质体融合物沉淀；

（6）融合子再生：将步骤（5）得到的原生质体融合物沉淀重悬，取悬液涂布于PDA再生培养基上，20～30℃培养10～20 d，菌落长出后挑出并转接，即得融合子；

所述的巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法还包括将步骤（6）得到的融合子进行包括拮抗试验、菌落表型、菌丝形态、菌丝生长速度、出菇试验及简单重复序列区间在内的融合株综合验证过程；

步骤（1）中所述的培养基为液体PDA培养基：浸汁马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO4 

1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、蒸馏水定容至1000 mL，pH自然；

步骤（2）中所述的巨大口蘑混合酶液和双孢蘑菇混合酶液均采用渗透压稳定剂溶解纤维素酶和蜗牛酶得到；

所述的质量体积比为30%的PEG缓冲液的成分配比为：质量体积比为30%的PEG6000、50 mmol/L CaCl2、pH7.5的Tris‑HCl 10 mmoL/L；

步骤（6）中所述的PDA再生培养基为PDA培养基中含有0.6 mol/L KCl，pH=7.0；

所述的渗透压稳定剂以0.6 moL/LKCl与0.6 mol/L甘露醇按照体积比1:1～1:1.5复配得到；

所述的质量体积比为30%的PEG缓冲液用量为按照1 mL质量体积比为30%的PEG缓冲液6

与巨大口蘑原生质体、双孢蘑菇原生质体各0.5×10个配比；

步骤（2）中所述的酶解的酶解液用量均为以湿重计每0.3～0.5 g菌丝加入1 mL混合酶解液；

步骤（5）中所述的混合是将灭活处理的巨大口蘑原生质体悬液和双孢蘑菇原生质体悬液按照体积比1:1混合；

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步骤（3）中所述的纯化的原生质体悬液浓度为1×10个/mL；

步骤（2）中所述的巨大口蘑菌丝体的酶解为31℃酶解4.5 h；

步骤（2）中所述的双孢蘑菇菌丝体的酶解为32℃酶解2.2 h；

步骤（4）中所述的紫外灯灭活处理是采用15W紫外灯于25 cm处照射巨大口蘑原生质体

18 min灭活；

步骤（4）中所述的热灭活处理是采用56℃水浴热灭活双孢蘑菇原生质体30 min；

步骤（3）中所述的洗涤和重悬均采用渗透压稳定剂；

步骤（3）中所述的离心为3000～4000 r/min离心15～20 min；

步骤（5）中所述的洗涤为采用渗透压稳定剂洗涤以去除PEG；洗涤的次数为2次；

步骤（6）中所述的重悬为采用渗透压稳定剂重悬；

步骤（6）中所述的培养为26℃避光培养。