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专利号: 2019105046466
申请人: 辽宁大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.筛选抑制细胞膜蛋白过度表达药物的方法,其特征在于:方法如下:

1)使用细胞刮刀将过表达小胶质细胞从培养瓶中分离,种在26个6孔板中使细胞数量

5

为5×10个,待4h细胞贴壁后,加入浓度为5 μg/ml的药物,置于5% CO2培养箱中培养24h;取出细胞用冷PBS吹洗三遍后,用细胞刮刀将细胞从6孔板中分离,随后用1000 r/min,4℃的离心机离心4min,重新分散于1ml 10mmol/L Tris‑HCl缓冲溶液中,利用细胞破碎仪在300w的条件下,超声3s,间隔7s,持续3min进行细胞破碎;根据差速离心法,置于低温离心机中进行细胞膜蛋白的分离;得到沉淀物置于冰上加入膜蛋白裂解液裂解,经过滤后测其浓度,置于‑80℃中保存待用,得药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液;

2)将步骤1)获得的药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液,用PBS稀释,得蛋白质浓度为50 ug /mL的药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液;

3)将纳米荧光探针过滤、透析、冻干,取0.004g冻干后的纳米荧光探针溶于200mL PBS缓冲溶液中,得浓度为0.02 mg/mL的纳米荧光探针溶液;所述纳米荧光探针溶液制备方法包括如下步骤:称取13 mmol组氨酸和2 mmol缬氨酸,溶于20 mL超纯水中,加入3 mmoL乙二胺,完全超声溶解后,在反应釜中210℃ 条件下加热15 h,得到纳米荧光探针溶液;

4)在96孔板中,每个孔中加入100μL步骤2)制备的蛋白质浓度为50 ug /mL的药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液,每个孔中再加入100 μL浓度为0.02mg/mL的纳米荧光探针溶液,在20℃下孵化5min后,在荧光酶标仪上检测荧光强度值。