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专利号: 2019103735623
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种构建冠状病毒感染性克隆方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:S1:提取该冠状病毒的RNA,反转录获得cDNA;

S2:将步骤S1所得cDNA片段化,得到包含cDNA全基因的各片段,其中所述片段的首片段包括T7启动子,所述各片段相邻两片段间含有50~70bp重叠区域作为重组同源臂,所述片段化的方法为PCR扩增;

S3:PCR扩增得到包含丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子的终止片段,再利用线性质粒载体分别与步骤S2中各片段连接或组装,筛选获得分别包括步骤S2中各片段的重组质粒,其中所述质粒载体包含抗性筛选基因;

S4:随机选取步骤S3所得重组质粒中的一个做无义突变,得标记片段;

S5:酶切或PCR扩增步骤S3和S4所得重组质粒,获得包括步骤S2中各片段和S4标记片段的片段集合,将目标质粒载体与片段集合、步骤S2的终止片段同源重组,筛选得到阳性克隆,其中,所述目标质粒载体为严紧型质粒,容量为1~60Kb,所述同源重组为RED/ET重组技术介导下的同源重组;

S6:将步骤S5所得阳性克隆与辅助质粒共转染可表达T7RNA聚合酶的细胞系,能成功拯救获得该冠状病毒反向遗传株的阳性克隆即为包含该冠状病毒全基因组的感染性克隆。

2.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法,其特征在于,步骤S5中所述目标质粒载体为线性载体p15A-cm,所述同源重组所使用的感受态工程菌为GBdir E.coli。

3.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法,其特征在于,所述步骤S5中阳性克隆的筛选温度为20~30℃。

4.根据权利要求1所述构建冠状病毒感染性克隆方法,其特征在于,所述步骤S6中辅助质粒包含表达核衣壳蛋白的基因。

5.一种权利要求1~4任意一项所述构建冠状病毒感染性克隆方法在制备鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆中的应用。

6.一种鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:SS1:提取鸡传染性支气管炎病毒疫苗株的RNA,转录获得cDNA;

SS2:以步骤SS1所述cDNA为模板,PCR扩增包含T7启动子和鸡传染性支气管炎病毒疫苗株全基因的A、B、C、D四个片段,以基因合成的pUC47-HDVR-T7 ter为模板,扩增包含丁型肝炎病毒核酶序列(HDVribozyme)及T7终止子(T7 terminator)的片段E;

SS3:将线性质粒pBR322为模板,与步骤SS2中A、B、C、D四个片段分别同源重组,得到分别包含A、B、C、D片段的重组质粒;

SS4:选取步骤SS3所得包含D的重组质粒,将其中部分碱基做无义突变,记为突变片段载体pDt;

SS5:以质粒p15A-cm-ccdB为模板,扩增得到用于感染性克隆组装的线性载体p15A-cm,酶切步骤SS3和SS4中重组质粒,获取A、B、C和Dt片段,将片段A、B、C、Dt、E和线性载体p15A-cm共转入感受态细胞GBdir E.coli中,抗性筛选获得阳性克隆;

SS6:以步骤SS1所得cDNA为模板,扩增得到的N基因再与质粒pVAX1同源重组,构建得到表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N;

SS7:将步骤SS6所述表达N基因的真核表达质粒pVAX1-N与步骤SS5所得阳性克隆共转染BSR-T7/5细胞,能成功拯救获得鸡传染性支气管炎病毒反向遗传株的阳性克隆即为含有该鸡传染性支气管炎病毒全基因组的感染性克隆。

7.根据权利要求6所述鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆的构建方法,所述鸡传染性支气管炎病毒疫苗株为H120。

8.一种利用权利要求6或7所述构建方法得到的鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆。

9.一种权利要求8所述鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆在制备载体疫苗中的应用。