1.一种小鼠截短IL-36α蛋白的生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)构建pUC57-mIL-36α质粒:合成小鼠截短IL-36α蛋白基因,克隆入pUC57载体质粒,构建pUC57-mIL-36α质粒;
2)PCR扩增:以P1和P2为特异性引物,在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点,以pUC57-mIL-36α质粒为模板,进行PCR扩增;所述的特异性引物P1和P2的序列为:P1:5’-GGGCCATGGGCAGAGCAGCAAGCCC-3’
P2:5’-CCCCTCGAGATGCACCCACGATCATTTC-3’
3)pET28a-mIL-36α重组表达载体的构建:将PCR扩增产物和pET28a载体质粒分别用NcoⅠ、XhoⅠ进行双酶切,双酶切后凝胶回收IL-36α与pET28a载体,回收后的IL-36α与pET28a载体经T4连接酶定向连接,构建重组表达载体pET28a-mIL-36α;
4)转化:将重组表达载体pET28a-mIL-36α转化大肠杆菌BL21,获得IL-36α重组工程菌;
5)小鼠截短IL-36α蛋白的诱导表达:将IL-36α重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中,37℃、200r/min震荡培养过夜;次日,以1:100比例扩大培养,37℃、210r/min震荡培养
3h,至OD600达到0.6时,加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG,进行诱导表达,获得菌体;
6)小鼠截短IL-36α蛋白的纯化:采用超声破碎法将获得的菌体裂解,离心取上清液,用Ni-NAT对上清液进行纯化,得纯化的小鼠截短IL-36α蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠截短IL-36α蛋白的生产方法,其特征在于,步骤2)中,PCR反应体系为:2×PfuMasterMix25μL,P1、P2引物各2μL,pUC57-mIL-36α质粒模板0.2μL,加双蒸水补充至50μL;PCR反应条件为:94℃预变性2min;94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸35s,扩增30个循环;72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠截短IL-36α蛋白的生产方法,其特征在于,步骤5)中,诱导表达的条件为:16-20℃,120r/min,20h。
4.根据权利要求3所述的一种小鼠截短IL-36α蛋白的生产方法,其特征在于,步骤5)中,诱导表达的条件为:20℃,120r/min,20h。
5.根据权利要求1所述的一种小鼠截短IL-36α蛋白的生产方法,其特征在于,步骤6)中,将上清液注入Ni-NAT柱中,用50mM-200mM咪唑洗脱,收集洗脱液,获得目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种小鼠截短IL-36α蛋白的生产方法,其特征在于,步骤6)中,将上清液注入Ni-NAT柱中,先用50mM咪唑洗脱,弃洗脱液,再用200mM咪唑洗脱,收集洗脱液,获得目的蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种小鼠截短IL-36α蛋白的生产方法,其特征在于,所述的小鼠截短IL-36α蛋白的,DNA序列如SEQ ID NO.2所示。