1.一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,包括如下步骤:将GH36族α-半乳糖苷转移酶、乳糖、肌醇半乳糖苷和缓冲液,充分混合均匀,形成酶促反应体系,将酶促反应体系放入恒温箱,在35~50℃下,反应1~3h,得粗产物。
2.根据权利要求1所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,还包括分离纯化步骤:将所得粗产物加热至100℃灭酶5min,离心,取上清液;将上清液脱盐;脱盐后的上清液倒入分离柱Li Chrosorb 100NH2柱中,按体积比,流动相为CH3CN:H2O=75:25,流速为1mL/min,通过制备液相方式进行分离纯化。
3.根据权利要求1或2所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,所述的酶促反应体系是,反应体系内,GH36族α-半乳糖苷转移酶的终浓度为0.2~0.5U/mL,乳糖的终浓度为5~25mM,肌醇半乳糖苷的终浓度为5~15mM,用缓冲液定容。
4.根据权利要求1或2所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,所述的GH36族α-半乳糖苷转移酶的制备方法包括如下步骤:
1)构建含有GH36族α-半乳糖苷转移酶基因的重组工程菌;
2)将步骤1)获得的重组工程菌经诱导培养表达酶蛋白;
3)收集菌体细胞,细胞超声波破碎,离心取上清液,获得粗酶液;
4)将粗酶液经一步纯化,制得GH36族α-半乳糖苷转移酶。
5.根据权利要求4所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,步骤1)具体为:以水稻基因(Oryza sativa L.var.Nipponbare)的cDNA(GenBank NO.BAB64768.1)为模板,以特异性引物进行PCR扩增,获得GH36族α-半乳糖苷转移酶基因;
将GH36族α-半乳糖苷转移酶基因和表达载体PET-28a进行双酶切后,连接构建重组质粒;将重组质粒转入到大肠杆菌BL-21中,获得含有GH36族α-半乳糖苷转移酶基因的重组工程菌;
所述的特异性引物的核苷酸序列为:
上游引物:
下游引物:
6.根据权利要求4所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,步骤2)具体为:将重组工程菌以1%的接种量接种于含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中,于170~200rpm培养至初始菌密度OD600=0.3时,加入IPTG至终浓度为20~30μM,在35-40℃、170~200rpm下诱导培养24~32小时。
7.根据权利要求4所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,步骤4)具体为:纯化采用HisTrapTMHP镍亲和柱,经亲和层析方法制得GH36族α-半乳糖苷转移酶提取液。
8.根据权利要求1或2所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的新方法,其特征在于,所述的缓冲液是pH=6.0~8.0的McIlvaine buffer。