1.一种大肠杆菌在生产琥珀酸中的应用,其特征在于,通过抑制大肠杆菌中丙酮酸激酶的活性,提高大肠杆菌产琥珀酸的能力,具体步骤包括:(1)克隆大肠杆菌中的丙酮酸激酶基因pykA;
(2)以克隆得到的pykA作为亲本,构建酶活下降的丙酮酸激酶突变体;
(3)将大肠杆菌的丙酮酸激酶基因pykA替换为丙酮酸激酶突变体基因,得到重组大肠杆菌;
(4)在种子培养基中活化重组菌;
(5)接种活化后的重组菌到发酵培养基中发酵;
所述大肠杆菌为大肠杆菌FMME-SuA,所述大肠杆菌已于2018年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2018568,保藏地址为中国湖北武汉,武汉大学;
步骤(3)中所述的丙酮酸激酶突变体为pykA,编码该酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;
步骤(3)中重组大肠杆菌构建方法包括用Red同源重组技术将原始菌株中的丙酮酸激酶基因pykA替换为酶活下降的丙酮酸激酶突变体基因。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(4)所述的活化是将重组大肠杆菌在
30-40℃,200rpm振荡培养12-14h。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(5)所述的发酵是按10-25%的接种量接种种子液至发酵培养基中,30-40℃下搅拌100-150rpm,厌氧发酵50-65h;所用培养基中包括:葡萄糖90-120g/L,玉米浆4-10g/L,Na2HPO4·12H2O 1-2g/L,NaH2PO4·2H2O 2-3g/L,MgSO4·7H2O 0.2-0.3g/L,CaCl2 0.1-0.2g/L。
4.一种产琥珀酸的大肠杆菌FMME-SuA,其特征在于,所述大肠杆菌已于2018年8月27日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2018568,保藏地址为中国湖北武汉,武汉大学。
5.一种重组大肠杆菌,其特征在于,是以权利要求4所述的大肠杆菌FMME-SuA为出发菌株,采用Red同源重组方法,将如SEQ ID NO.9所示的pykA基因的DNA片段导入大肠杆菌FMME-SuA中,替换大肠杆菌FMME-SuA中的丙酮酸激酶基因pykA得到的。
6.权利要求4所述的大肠杆菌在生产琥珀酸中的应用。
7.权利要求5所述的重组大肠杆菌在生产琥珀酸中的应用。